人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在大腸桿菌和酵母中的表達(dá)、純化及其特性分析.pdf

1、酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(acidicfibroblastgrowthfactor,aFGF)是一種存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)組織中，對(duì)中胚層和神經(jīng)外胚層來源的多種細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)和促分裂分化作用的重要生長(zhǎng)因子。aFGF廣泛參與多種生理和病理過程，在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)，誘導(dǎo)血管形成及再生等方面具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。研究目的：利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)活性蛋白不僅可以大幅提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量，還能按照人們的需要改變蛋白的特性，生產(chǎn)出具有優(yōu)良特性

2、和新功能的生物活性藥用蛋白。盡管aFGF是一種生物學(xué)效應(yīng)廣泛的生長(zhǎng)因子，但在實(shí)際應(yīng)用于某種疾病治療時(shí)，人們更希望它具有較好的細(xì)胞特異性。目前商品化的haFGF(humanacidicfibroblastgrowthfactor)幾乎都是利用大腸桿菌表達(dá)的重組haFGF，缺乏明顯的細(xì)胞特異性。先后有人采用定點(diǎn)突變的方法對(duì)haFGF的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，但在細(xì)胞特異性方面沒有取得明顯的效果。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白質(zhì)的翻譯后修飾加工能力，能對(duì)表達(dá)的外

3、源蛋白進(jìn)行糖基化修飾，而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)沒有這一特點(diǎn)。對(duì)haFGF的mRNA序列分析發(fā)現(xiàn)haFGF中存在一些潛在的糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分布在haFGF的三個(gè)功能區(qū)。糖基化修飾影響蛋白質(zhì)功能已經(jīng)得到了大量證實(shí)，利用真核異源表達(dá)系統(tǒng)對(duì)haFGF進(jìn)行糖基化修飾可望實(shí)現(xiàn)對(duì)haFGF特性的改變，尤其當(dāng)修飾發(fā)生在重要的功能區(qū)時(shí)，可能使haFGF產(chǎn)生新的優(yōu)良特性，增加新的功能，加寬其臨床應(yīng)用的范圍。我們構(gòu)建haFGF的酵母表達(dá)系統(tǒng)，目的就是利用酵母本

4、身所具有的蛋白質(zhì)修飾加工系統(tǒng)，表達(dá)發(fā)生了特性改變的重組haFGF，實(shí)現(xiàn)對(duì)haFGF功能的改進(jìn)，增加其細(xì)胞特異性。 研究方法：本研究采用RT-PCR方法，進(jìn)行了haFGF基因克??；通過添加限制性酶切位點(diǎn)將haFGF基因定向克隆到相應(yīng)的表達(dá)載體上，構(gòu)建了haFGF的E.coli、S.cerevisiae和P.pastoris三種表達(dá)系統(tǒng)；采用ELISA檢測(cè)體系對(duì)E.coli/haFGF、S.cerevisiae/haFGF和P.pa

5、storis/haFGF的發(fā)酵和表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化；采用肝素親和層析和凝膠過濾層析方法分別對(duì)E.coli、S.cerevisiae和P.pastori表達(dá)的rhaFGF進(jìn)行了分離純化；采用SDS-PAGE和Westernblot對(duì)純化的目標(biāo)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)P.pastoris表達(dá)的haFGF進(jìn)行了特性鑒定：包括生物活性、穩(wěn)定性和對(duì)血管細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 研究結(jié)果：1.利用RT-PCR方法從患子宮肌瘤的婦女子宮內(nèi)膜組織中成功克隆到了

6、兩種不同剪接方式的haFGF基因的編碼區(qū)cDNA片段。測(cè)序結(jié)果表明其中一個(gè)cDNA片段由3個(gè)外顯子構(gòu)成，另一個(gè)cDNA片段由2個(gè)外顯子組成。 2.以BL21(DE3)為宿主菌、pET30a(+)為表達(dá)質(zhì)粒，成功構(gòu)建了E.coli/haFGF表達(dá)系統(tǒng)。利用肝素-sepharoseCL-6B親和層析從誘導(dǎo)后的E.coli/haFGF細(xì)胞中分離純化出rhaFGF(E)(Recombinedhumanacidicfibroblastgr

7、owthfactorexpressedbyE.coli)，經(jīng)腸激酶酶切處理切除6×His標(biāo)簽后，得到了電泳純的分子量為17kD的rhaFGF(E)。 3.以INVSc1為宿主菌，pYES2為表達(dá)質(zhì)粒，成功構(gòu)建了S.cerevisiae/haFGF表達(dá)系統(tǒng)。Dotblot證實(shí)經(jīng)60h搖瓶誘導(dǎo)，rhaFGF(S)(RecombinedhumanacidicfibroblastgrowthfactorexpressedbvS.cere

8、visiae)表達(dá)量達(dá)到最高。利用肝素-sepharoseCL-6B親和層析從細(xì)胞中純化出rhaFGF(S)，其分子量為43kD。rhaFGF(S)分子量顯著增加表明該蛋白進(jìn)行了翻譯后修飾，發(fā)生了結(jié)構(gòu)改變。 4.以KM71為宿主菌，pPIC9K為表達(dá)質(zhì)粒，成功構(gòu)建了P.Pastoris/haFGF表達(dá)系統(tǒng)。haFGF基因在該系統(tǒng)中通過整合到宿主的染色體上的方式進(jìn)行外源基因的表達(dá)，表達(dá)方式為分泌型。從G418濃度為0.75g/L的

9、轉(zhuǎn)化平板上篩選到表達(dá)量相對(duì)較高的重組子。pH6.0，0.5％甲醇誘導(dǎo)48h是最佳搖瓶發(fā)酵條件，在該條件下表達(dá)的rhaFGF(P)(RecombinedhumanacidicfibroblastgrowthfactorexpressedbyP.pastoris)經(jīng)肝素-sepharoseCL-6B親和層析和G100凝膠過濾純化，得到兩種分子量分別為17kD、35kD的蛋白，經(jīng)Westernblot證實(shí)，二者都是目標(biāo)蛋白rhaFGF(P)：

10、rhaFGF(P1)，17kD；rhaFGF(P2)，35kD。rhaFGF(P2)分子量增加，說明蛋白發(fā)生了翻譯后修飾，有結(jié)構(gòu)改變。 5.rhaFGF(P)的生物活性、穩(wěn)定性和促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)和平滑肌細(xì)胞(SMC)增殖的特性。 rhaFGF(P1)促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖的活性比標(biāo)準(zhǔn)品haFGF高24％，rhaFGF(P2)的生物活性比標(biāo)準(zhǔn)品haFGF低51％； rhaFGF(P1)、rhaFGF(P2

11、)與標(biāo)準(zhǔn)品haFGF一樣在水溶液中的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較差。4℃處理rhaFGF后，其增殖能力很快下降，rhaFGF(P1)9天后完全失活、rhaFGF(P2)7天后完全失活。60℃處理，rhaFGF(P1)7.5min后完全失活，rhaFGF(P2)6min后完全失活； 與標(biāo)準(zhǔn)品E.coli表達(dá)的rhaFGF相比，低濃度下rhaFGF(P1)能更加有效地促進(jìn)EC生長(zhǎng)，抑制SMC增殖。高濃度rhaFGF(P1)強(qiáng)烈促進(jìn)SMC增殖，rha

12、FGF(P1)濃度為35.3nmol/L時(shí)促進(jìn)SMC增殖能力最大，可達(dá)到對(duì)照的3.5-4倍；rhaFGF(P1)濃度為3.53-11.76nmol/L時(shí)EC增殖達(dá)到最大，為對(duì)照的1.5倍。因此，在促進(jìn)活體血管內(nèi)皮愈合和防止內(nèi)膜增生的作用上，低濃度rhaFGF(P1)很可能比E.coli表達(dá)的rhaFGF更有優(yōu)勢(shì)，這對(duì)于預(yù)防血管成形術(shù)后再狹窄具有十分重要的意義。 rhaFGF(P2)雖然在本研究中沒有表現(xiàn)出顯見的優(yōu)良特性，但作為一