綠膿桿菌ATCC27853菌株外毒素A全長編碼基因的克隆及其在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)是重要的人畜共患病原菌。綠膿桿菌感染可發(fā)生在人體任何部位和組織，引起心內(nèi)膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥；在幼小畜禽中往往大群暴發(fā)，常與大腸桿菌混合感染，或者是出殼雛雞接種馬立克氏病疫苗造成綠膿桿菌嚴(yán)重感染，1～2天內(nèi)死亡達(dá)70％～80％。綠膿桿菌能產(chǎn)生多種與毒力有關(guān)的物質(zhì)，其中綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A，PEA)是一種致

2、死性外毒素，是綠膿桿菌最主要的致病因子。人們已經(jīng)對(duì)PEA的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制有一定的研究，在此基礎(chǔ)上，人們利用基因工程技術(shù)將它改造為具有醫(yī)療用途的蛋白質(zhì):利用PEA的細(xì)胞毒性作用制成免疫毒素，作為治療癌癥的藥物；利用PEA很好的免疫原性制備防治綠膿桿菌感染的基因工程疫苗或?qū)EA作為蛋白疫苗佐劑和疫苗載體，可以大大提高免疫原性；利用PEA能夠攜帶蛋白質(zhì)或DNA進(jìn)入細(xì)胞中的特殊功能，將其應(yīng)用于基因治療。PEA的上述重要的臨床應(yīng)用一直刺激著對(duì)P

3、EA.的分子結(jié)構(gòu)和功能的研究。然而綠膿桿菌菌株多，毒力差異大，GeneBank已發(fā)表的全長PEA序列只有三個(gè)(K01397，strain PA103；AE00409l，strain PA01；CP000438，strain UCBPP-PA14)，Blast分析結(jié)果顯示它們的PEA堿基序列與氨基酸序列均存在著差異。研究不同菌株間PEA結(jié)構(gòu)和PEA蛋白生物活性的差異可以揭示PEA結(jié)構(gòu)與細(xì)胞毒性及免疫原性的關(guān)系，從而使PEA更好的應(yīng)用于免疫

4、毒素、疫苗方面和基因治療。因此本實(shí)驗(yàn)擬克隆綠膿桿菌產(chǎn)毒株ATCC27853的PEA全長編碼基因序列，以提供素材用于PEA結(jié)構(gòu)的比較研究。本實(shí)驗(yàn)也對(duì)克隆的PEA基因進(jìn)行了序列分析，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.1A/PEA，將其轉(zhuǎn)染人腎胚胎上皮細(xì)胞-HEK293T細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了PEA基因在真核細(xì)胞中的分泌性表達(dá)，以便今后進(jìn)一步研究PEA結(jié)構(gòu)與細(xì)胞毒性和免疫原性的關(guān)系，從而為PEA的細(xì)胞毒性和免疫原性在免疫毒素、疫苗和基因治療方面的應(yīng)用奠

5、定基礎(chǔ)。 方法：本研究根據(jù)GeneBank已發(fā)表的綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)毒株P(guān)A103序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，從綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853菌株中提取細(xì)菌基因組DNA，以此為模板，用PCR方法擴(kuò)增綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosaexotoxin A, PEA)全長編碼基因，利用pMD18-T載體構(gòu)建PEA的克隆載體pMD18-T/PEA，經(jīng)過藍(lán)白斑篩選，限制性內(nèi)切

6、酶Hind Ⅲ和Xba I雙酶切鑒定和PEA基因內(nèi)部的Kpn I單酶切鑒定后，進(jìn)行PEA基因序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與GeneBank已發(fā)表的PA103菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，確定克隆的基因確是綠膿桿菌ATCC27853菌株P(guān)EA全長編碼基因后，將PEA亞克隆入pcDNA3.1A真核表達(dá)載體，用克隆位點(diǎn)的Hind Ⅲ和Xba I以及PEA基因內(nèi)部的Apa I對(duì)重組質(zhì)粒pcDNA3.1A/PEA進(jìn)行酶切鑒定。為鑒定帶有原信號(hào)肽(原核生物信號(hào)肽)的

7、PEA基因能否在真核細(xì)胞中表達(dá)，本研究用真核表達(dá)載體pcDNA3.1A/PEA轉(zhuǎn)染人腎胚胎上皮細(xì)胞-HEK 293T細(xì)胞，同時(shí)用pcDNA3.1A空載體轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。通過多次試驗(yàn)建立了磷酸鈣方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。用Western blot方法檢測(cè)PEAl的表達(dá)。 結(jié)果:以基因組DNA為模板，利用PCR方法擴(kuò)增PEA基因后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1條符合預(yù)期片段大小的特異

8、性片段，即1914 bp。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，經(jīng)酶切鑒定正確后，把重組質(zhì)粒pMD18-T/PEA送公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GeneBank已發(fā)表的PA103菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，確定本實(shí)驗(yàn)克隆的基因確是綠膿桿菌ATCC27853菌株P(guān)EA全長編碼基因。將PEA基因亞克隆入pcDNA3.1A真核表達(dá)載體，酶切重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果符合預(yù)期片段大小。結(jié)果證明pcDNA3.1A/PEA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pcD

9、NA3.1A/PEA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示在分子量約為130 KDa處有一條明顯的雜交帶，而空載體在相應(yīng)位置未見雜交帶。 結(jié)論:從綠膿桿菌ATCC27853菌株基因組DNA中擴(kuò)增出PEA全長編碼基因；序列分析發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌ATCC27853菌株與標(biāo)準(zhǔn)毒株P(guān)A103的基因序列和氨基酸序列均存在著差異，同源性均達(dá)99％；成功構(gòu)建了PEA基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1A/PEA，并將其轉(zhuǎn)