野生型NF2基因質(zhì)粒的構(gòu)建及其在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的：II型多發(fā)神經(jīng)纖維瘤病(NF2)基因是聽神經(jīng)瘤的腫瘤抑制基因，目前NF2基因編碼的蛋白merlin的抑瘤作用機(jī)制仍不清楚。近年來研究提示肝細(xì)胞生長因子(HGF)調(diào)節(jié)的酪氨酸激酶底物(HRS)是merlin的效應(yīng)蛋白，蛋白merlin 與HRS蛋白作用后可大大增強(qiáng)蛋白merlin的抑制腫瘤增殖能力。為明確蛋白merlin 與HRS蛋白相互作用后抑制腫瘤的具體機(jī)制，本研究通過構(gòu)建pEGFP-NF2 II 型基因，并從基因序列測序、蛋白

2、表達(dá)以及這種蛋白對瘤細(xì)胞增殖的影響等三方面來驗(yàn)證所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性，為下一步繼續(xù)深入研究蛋白merlin 抑瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 方法：從人的cDNA胎腦文庫中擴(kuò)增目的基因并構(gòu)建pEGFP-NF2 II型基因質(zhì)粒，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增并抽提，測定質(zhì)粒OD值。行雙酶切后做DNA瓊脂糖電泳粗測質(zhì)粒，然后將精確測序結(jié)果與NCBI的標(biāo)準(zhǔn)序列比對。把pEGFP-NF2 II型基因轉(zhuǎn)染至RT4細(xì)胞中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用水溶性四氮

3、唑（WST-1）法觀察merlin蛋白 II型對細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果：測序結(jié)果顯示，所構(gòu)建的pEGFP-NF2 II型基因與標(biāo)準(zhǔn)序列相符率為100％。DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒結(jié)果為：pEGFP cDNA大小為4.7kb；NF2 cDNA大小為1.77kb。細(xì)胞熒光檢測蛋白merlin在RT4細(xì)胞中都可以表達(dá)，western-blotting測定merlin-GFP融合蛋白為90KD左右，同理論值相一致。WS