嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SSG的構(gòu)建以及在真核細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、齲病是一種以細(xì)菌為主的多種因素導(dǎo)致的牙體硬組織的慢性感染性疾病，變形鏈球菌是目前公認(rèn)的主要致病菌之一。變形鏈球菌在牙面的粘附、聚集、增殖和產(chǎn)酸是其致齲的主要原因。阻斷牙面粘附、聚集過程，可降低齲病的發(fā)生率。目前認(rèn)為，免疫學(xué)預(yù)防措施是控制齲病的主要手段之一?；蛞呙缡巧鲜兰o(jì)90年代發(fā)展起來的一種誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的新方法，是人類免疫預(yù)防醫(yī)學(xué)史上的又一重大進(jìn)展，被譽(yù)為第三次疫苗革命。其基本原理是將外源性基因直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)對目

2、的基因所表達(dá)的蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。 表面蛋白SpaP和SpaP樣蛋白是變形鏈球菌的主要粘結(jié)素之一，為一類分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能相似的蛋白質(zhì)家族，主要與變形鏈球菌在牙面初始粘附、菌斑形成及齲病的發(fā)生密切相關(guān)。它的不同狀態(tài)可影響細(xì)菌粘附，它參與了變形鏈球菌在獲得性膜上蔗糖非依賴性粘附。它的主要粘附功能區(qū)和免疫活性區(qū)集中在其氨基末端富含丙氨酸的A區(qū)和中間部分富含脯氨酸的P區(qū)。 變形鏈球菌葡聚糖結(jié)合蛋白

3、(Gbps)是變形鏈球菌的主要致齲毒力因子之一，通過與細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)胞外多糖一葡聚糖結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)菌在牙面的粘附和聚集。它參與了變形鏈球菌在獲得性膜上的蔗糖依賴性粘附。目前，已有四種不同的Gbps被相繼發(fā)現(xiàn)，按照被研究的先后順序，分別命名為GbpA、GbpB、6bpC和GbpD。但這四種葡聚糖結(jié)合蛋白的分布不盡相同，確切的功能還不很清楚。GbpA是這四種葡聚糖結(jié)合蛋白中研究較為清楚的，它的核酸序列已被克隆并得到了相關(guān)蛋白分子的氨基酸序列，而

4、且，研究發(fā)現(xiàn)GbpA的葡聚糖結(jié)合區(qū)(GBD)可能為介導(dǎo)變形鏈球菌粘附的重要功能區(qū)。因此，如果能同時(shí)抑制SpaP和GbpA的功能，就能在一定程度上阻斷變形鏈球菌對牙面的非蔗糖依賴性粘附和蔗糖依賴性粘附，從而達(dá)到預(yù)防齲病的目的。 目的:本研究擬從變形鏈球菌UA159基因組DNA中用PCR法擴(kuò)增出GbpA的功能區(qū)(葡聚糖結(jié)合區(qū)GBD)的編碼區(qū)基因片段gg和Spap的P區(qū)編碼區(qū)基因片段sp，并將這兩個片段連同一段信號肽序列同時(shí)克隆到真核

5、表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建pVhX1-SSG真核表達(dá)質(zhì)粒作為基因疫苗，進(jìn)行真核表達(dá)融合蛋白的檢測，為下一步嵌合體孩齲DNA疫苗免疫哺乳動物獲得特異性抗體及抑齲實(shí)驗(yàn)研究做準(zhǔn)備，并為其在免疫防齲中的進(jìn)一步研究及應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:本研究共分為三個實(shí)驗(yàn)： 實(shí)驗(yàn)一：變形鏈球菌UA159 GbpA的GBD區(qū)基因和SpaP的P區(qū)基因的克隆和序列分析常規(guī)厭氧培養(yǎng)S.mutans UA159，提取細(xì)菌基因組DNA作為模板；根據(jù)Gen

6、bank報(bào)道的序列設(shè)計(jì)兩對引物，采用PCR方法擴(kuò)增GbpA的功能區(qū)(葡聚糖結(jié)合區(qū)GBD)的編碼區(qū)基因片段gg和SpaP的P區(qū)編碼區(qū)基因片段印；采用重疊延伸PCR法擴(kuò)增信號肽基因(signal)。將獲取的三個基因片段分別插入pMD20-T克隆載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 α，挑取陽性克隆，初步鑒定后測序。 實(shí)驗(yàn)二：嵌合體防齲DNA疫苗pVAX1-SSG真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將測序正確的signal、gg和sp的基因片段

7、分別雙酶切，膠回收純化后將同樣進(jìn)行雙酶切的pVAX1質(zhì)粒在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接反應(yīng)，獲得構(gòu)建的嵌合體防齲DNA疫苗pYAX1-SSG，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)Eoli DH5α，提取純化pVhX1-SSG，進(jìn)行質(zhì)粒RCR，酶切電泳鑒定并測序。 實(shí)驗(yàn)三：變形鏈球菌嵌合體真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-SSG在真核細(xì)胞中的表達(dá)通過轉(zhuǎn)染試劑將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至哺乳動物細(xì)胞COS-7中。用RT-PCR法檢測重組基因在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的情況，采用免疫組化染色

8、檢測細(xì)胞中pVAX1-SSG目的蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:利用PCR技術(shù)，克隆到gg和sp基因，和一段信號肽基因；序列分析結(jié)果與設(shè)計(jì)基因序列一致；通過雙酶切后連接反應(yīng)，成功構(gòu)建了嵌合體真核質(zhì)粒pVAX1-SSG;通過RT-PCR技術(shù)，證實(shí)pVAX1-SSG質(zhì)粒能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，通過免疫組化染色，證實(shí)pVAX1-SSG質(zhì)粒能在宿主細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的抗原蛋白。 結(jié)論:成功構(gòu)建了嵌合體真核質(zhì)粒pVAX1-ssG將重組質(zhì)粒，質(zhì)粒轉(zhuǎn)