pDsRed-Monomer-N1-ARNT真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在A549細(xì)胞中的表達(dá)分析.pdf

1、目的：芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子（The aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）也叫作缺氧誘導(dǎo)因子-1β（hypoxia-inducible factor-1β，HIF-1β），是芳香烴受體（The aryl hydrocarbon receptor，AhR）信號(hào)通路和缺氧誘導(dǎo)因子-1（The hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）信號(hào)通路的共同成分

2、，能夠介導(dǎo)兩條信號(hào)通路對(duì)外界環(huán)境的反應(yīng)，誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)并產(chǎn)生一系列生理生化反應(yīng)。AhR信號(hào)通路是調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)外源性有害化學(xué)物質(zhì)代謝的重要分子機(jī)制，而HIF-1信號(hào)通路是在許多病理狀態(tài)下機(jī)體調(diào)節(jié)適應(yīng)低氧微環(huán)境的關(guān)鍵途徑，但目前關(guān)于兩條信號(hào)通路到底是以何種方式相互作用還具有爭(zhēng)議性。既往研究普遍認(rèn)為，ARNT在細(xì)胞中的表達(dá)恒定。然而，近期有若干研究指出ARNT在缺氧環(huán)境的表達(dá)量呈現(xiàn)組織特異性，并隨著氧濃度的變化表達(dá)量存在差異。這可能提示了

3、AhR和HIF-1信號(hào)通路之間復(fù)雜關(guān)系的潛在原因。目前關(guān)于缺氧等環(huán)境下ARNT在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬探討在不同缺氧程度以及不同濃度B(a)P處理下，肺癌A549細(xì)胞中ARNT表達(dá)量的變化情況，以期為這兩條信號(hào)通路之間關(guān)系的研究提供一定的參考。
　　方法：采用RT-PCR法擴(kuò)增目的基因ARNT片段，構(gòu)建帶有紅色熒光標(biāo)簽的ARNT基因真核表達(dá)載體（pDsRed-Monomer-N1-ARNT系統(tǒng)）；采用脂

4、質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)介導(dǎo)重組質(zhì)粒在A549細(xì)胞中的表達(dá)；在不同氧濃度(20％,15%,10%,5%,2%O2,作用3h)條件下分別培養(yǎng)pDsRed-Monomer-N1-ARNT轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和正常A549細(xì)胞系，建立不同程度的缺氧狀態(tài)。運(yùn)用高內(nèi)涵細(xì)胞篩選系統(tǒng)的熒光呈像模塊，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中ARNT基因紅色熒光融合蛋白的熒光強(qiáng)度變化情況。運(yùn)用Western Blot檢查正常A549細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后ARNT的表達(dá)情況；采用不同濃度的B(a)P（0μM

5、、2μM、4μM及8μM，作用24h）處理pDsRed-Monomer-N1-ARNT轉(zhuǎn)染細(xì)胞系和正常A549細(xì)胞，運(yùn)用相同方法分別觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞系A(chǔ)RNT基因紅色熒光融合蛋白的熒光強(qiáng)度變化情況和正常A549細(xì)胞經(jīng)處理后ARNT的表達(dá)情況；
　　結(jié)果：pDsRed-Monomer-N1-ARNT重組質(zhì)粒大小為7.0kb，經(jīng)酶切鑒定和DNA序列測(cè)定證明載體構(gòu)建正確,轉(zhuǎn)染細(xì)胞后pDsRed-Monomer-N1-ARNT重組質(zhì)粒在A54

6、9細(xì)胞中成功表達(dá)；用不同缺氧程度分別處理pDsRed-Monomer-N1-ARNT轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，ARNT融合蛋白的熒光強(qiáng)度增加，差異具有顯著性（P<0.05）。用相同氧氣濃度處理正常A549細(xì)胞后，Western Blot結(jié)果顯示ARNT的表達(dá)量為1：1.2：1.8：3：5,表達(dá)量顯著增加(P<0.05)。用不同濃度B(a)P處理pDsRed-Monomer-N1-ARNT轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，ARNT融合蛋白的熒光強(qiáng)度沒有明顯變化，差異不具