真核表達(dá)載體pEGFP-PACAP的構(gòu)建及其在3T3-L1細(xì)胞上的表達(dá).pdf

1、肌內(nèi)脂肪含量是影響豬肉肉質(zhì)性狀的重要因素之一，增加豬肉中肌內(nèi)脂肪含量成為現(xiàn)今豬育種領(lǐng)域的研究熱點之一。脂肪細(xì)胞中甘油三酯積累量直觀地反映了機體脂肪組織含量。此外，研究發(fā)現(xiàn)動物脂肪的沉積與脂肪代謝是受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的復(fù)雜生理過程。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP）經(jīng)胰島素(insulin)和地塞米松(Dexamethasone，DXM

2、)的誘導(dǎo)能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪形成。然而，PACAP對前體脂肪細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生甘油三酯的作用還不清楚。
　　為探究豬PACAP基因的功能，本研究克隆了豬(Sus scrofa)PACAP基因(pPACAP)的cds全長531bp，研究其在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的PACAP mRNA的表達(dá)規(guī)律;并構(gòu)建了真核表達(dá)載體pEGF

3、P-PACAP，轉(zhuǎn)染至3T3-L1前體脂肪細(xì)胞，48h后檢測3T3-L1前體月旨肪細(xì)胞中的pPACAP mRNA和pacap-EGFP融合蛋白的表達(dá)水平及其他脂肪合成基因如脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coa carboxylase，ACC)mRNA的表達(dá)水平。
　　在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中，PACAP mRNA隨著脂肪細(xì)胞的成熟，其表達(dá)量逐漸上

4、升，在第4天時，表達(dá)量最高，第8天時，約80％的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞成熟，而PACAP mRNA表達(dá)量呈下降趨勢;雙酶切及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pPACAP基因的真核表達(dá)載體pEGFP-PACAP;真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中后，在熒光顯微鏡下，重組質(zhì)粒組和空載體組均發(fā)出綠色熒光，且48h時轉(zhuǎn)染效率最高，且PACAP、FAS、ACC mRNA表達(dá)水平均有顯著提高(P＜0.01)，pacap融合蛋白的表達(dá)量呈上升趨