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文檔簡介
1、動脈血栓形成是急性心肌梗塞和腦梗死的主要誘因,也是發(fā)達國家最常見的死亡原因。組織因子(TF)是生理性止血和病理性形成血栓的啟動因子,它在血栓形成中的起始作用越來越受到人們的重視。單核細胞作為動脈粥樣硬化斑塊中TF來源的細胞-泡沫細胞的前身,研究其TF的表達調控機制已經成為當前臨床醫(yī)學的熱點之一。國內外大量研究表明,不穩(wěn)定型心絞痛、急性冠狀動脈綜合癥、高血壓和高血脂等心腦血管疾病患者血液中單核細胞的TF都處在高表達的水平;同時發(fā)現(xiàn),具有抗
2、血栓作用以及血管內皮保護功能的KLF2基因在急性冠狀動脈綜合癥病人的單核細胞中表達明顯下調。因此,本研究旨在構建pEGFP-N3-KLF2高表達載體,并且觀察LPS對KLF2高表達載體轉染的THP-1細胞表達TF的影響,為豐富凝血理論提供新的實驗依據(jù)。
目的:構建pEGFP-N3-KLF2高表達載體,并且觀察LPS對KLF2高表達載體轉染的THP-1細胞表達TF的影響。
方法:從NCBI獲得klf2基因序列,
3、運用premier5.0軟件設計引物,運用PCR技術擴增klf2基因,電泳檢測正確后,進行純化回收,然后將純化回收產物連pEGFP-N3載體進行轉化,再挑單克隆以及搖菌,小提質粒,最后進行雙酶切檢測和PCR檢測,當兩項結果均正確時,送pEGFP-N3-KLF2新鮮菌液去測序。將單核細胞分為5組:①正常細胞組。②轉染空質粒組,③轉染高表達質粒組。④LPS組。⑤LPS+轉染高表達質粒組。分別培養(yǎng)2 h、12 h、24 h、48 h和72 h
4、后,用流式細胞術檢測各組各時間點TF蛋白表達變化。
結果:陽性克隆篩選和測序結果顯示,pE-GFP-N3-KLF2高表達載體構建成功。在實驗觀察的2 h至72 h內,正常組細胞各時間點TF表達基本一致,各觀察點間比較差異無統(tǒng)計學差異;與正常對照組相比,空載體組和高表達轉染質粒組TF表達也無顯著性差異(P>0.05)。LPS組表達TF從12 h起明顯增加,至48 h達到高峰,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學差異(p<0.01),
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