變異鏈球菌重組質粒pEGFP-N1-SrV+的構建及真核表達.pdf

1、齲病是一種以細菌為主的多種因素共同作用的牙體硬組織疾病，變異鏈球菌（S.mutans，簡稱變鏈菌）是目前公認的主要致病菌之一。變異鏈球菌在牙面粘附、聚集、增殖和產(chǎn)酸是其致齲的主要過程，因此，阻斷變異鏈球菌在牙面粘附、聚集，可降低齲病的發(fā)生率。目前，免疫學預防措施是控制齲病的重要手段之一?；蛞呙?，是上世紀90年代初逐漸發(fā)展起來的一種誘導免疫反應的新方法，是預防免疫醫(yī)學史上的又一座里程碑，被譽為第三次疫苗革命。其基本原理是將外源性基因直接

2、導入宿主細胞內(nèi)，誘導宿主免疫系統(tǒng)對目的基因所表達的蛋白產(chǎn)生免疫反應，進而達到預防和治療疾病的目的。
　　 變鏈菌表面蛋白（surface protein antigen，SpaP）是介導變鏈菌在牙面粘附、聚集的主要功能區(qū)。變鏈菌表面蛋白可變區(qū)（SrV+，V區(qū)）兩端連接著具有高度保守性的A區(qū)和P區(qū)，并可與A區(qū)或P區(qū)協(xié)同發(fā)揮致齲作用。SrV+具有粘附和凝集作用，參與變鏈菌在牙面粘附、聚集；同時，SrV+內(nèi)有B細胞表位，可單獨發(fā)揮免疫

3、原性；SrV+蛋白還可以通過植物凝集素樣物質，刺激單核細胞釋放TNF-α因子。因此，變鏈菌表面蛋白SrV+是其重要的毒力因子，參與致齲過程，SrV+編碼基因為srv+。
　　 [目的]本研究根據(jù)已報道的變鏈菌表面蛋白SrV+基因srv+的核苷酸序列，化學合成其編碼基因，鑒定無誤后，將此片段連接到加強型綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-N1中，構建真核表達質粒pEGFP-N1-SrV+，進行瞬時轉染哺乳動物細胞293T，并檢測其

4、目的蛋白表達情況，為進一步的動物實驗研究打下基礎。
　　 [方法]本研究分為兩個實驗
　　 實驗一：重組質粒pEGFP-N1-SrV+的構建
　　 根據(jù)已報道的srv+基因核苷酸序列，化學合成SrV+的編碼基因srv+，將載體質粒pEGFP-N1和測序正確的srv+基因片段分別用KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切形成粘性末端，進行連接反應，獲取重組質粒pEGFP-N1-SrV+，進一步對其進行PCR、酶切和測序鑒定。

5、>　　 實驗二：重組質粒pEGFP-N1-SrV+在真核細胞中的表達
　　 通過脂質體介導重組質粒pEGFP-N1-SrV+瞬時轉染哺乳動物細胞293T。運用免疫組化SABC法和熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白標記的目的蛋白在真核細胞293T中表達的情況。
　　 [結果]通過基因化學合成技術，獲得1136bp的目的基因srv+核苷酸序列，與設計的目的基因序列一致；目的基因srv+和載體pEGFP-N1分別雙酶切制備后連接，成

6、功構建真核表達質粒pEGFP-N1-srV+；PCR擴增可獲得1.33Kb目的基因片段；KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切可見4.7kb和1.1kb兩條電泳條帶；經(jīng)測序分析合成片段srv+的序列與變鏈菌UA159基因序列比對同源性為96％，重組質粒pEGFP-N1-SrV+攜帶目的基因；通過熒光顯微鏡觀察和免疫組化SABC法檢測，質粒pEGFP-N1-SrV+轉染真核細胞293T后，在細胞中可見目的蛋白SrV+特異性表達。
　　 [結論]