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文檔簡介
1、目的:
本課題組前期研究證明,Toll樣受體4(TLR4)及相關(guān)分子-髓樣分化因子88(MyD88)、髓樣分化蛋白-2(MD-2)參與抗β2糖蛋白Ⅰ抗體/β2糖蛋白Ⅰ(anti-β2GPI/β2GPI)復(fù)合物誘導(dǎo)人單核細胞株THP-1表達組織因子(TF),且部分依賴膜聯(lián)蛋白Ⅱ(ANX2),成為抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)血栓形成的機制之一。本文著重探討TLR4信號通路中另一分子
2、家族-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細胞表達TF中的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。
方法:
1、利用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細胞TF mRNA的表達,采用試劑盒檢測細胞TF活性。
3、
2、Western bloting檢測anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激THP-1細胞MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)表達及其磷酸化情況,并檢測anti-β2GPI/β2GPI刺激的時效性和特異性。
3、采用TLR4抑制劑TAK-242預(yù)處理THP-1細胞,觀察其對anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干預(yù)作用。
4、 4、采用IRAKs抑制劑sc-204013預(yù)處理THP-1細胞,觀察其對anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化的干預(yù)作用。
5、采用MAPKs抑制劑SB203580(p38抑制劑)、U0126(ERK1/2抑制劑)、SP600125(JNK1/2抑制劑)預(yù)處理THP-1細胞,觀察其對anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)THP-1細胞表達TF的干預(yù)作用。
5、r> 結(jié)果:
1、Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物(100μg/ml)能顯著增加THP-1細胞TF mRNA水平及TF活性(與未刺激對照比較p<0.05)
2、Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物(100μg/ml)能顯著增加THP-1細胞p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平,并顯示時間效應(yīng),于刺激30 min時磷酸化最強(與未刺激比較p<0.05)。Anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合
6、物(100μg/ml)和LPS(500 ng/ml)對THP-1細胞MAPKs磷酸化的刺激效應(yīng)一致。
3、TLR4抑制劑TAK-242(5μM)能夠顯著降低anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的p38、ERK1/2及JNK1/2磷酸化水平(與未經(jīng)TAK-242處理組比較p<0.05)。
4、IRAKs抑制劑sc-204013(50μM)能夠降低anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物誘導(dǎo)的p38、ERK1
7、/2及JNK1/2磷酸化水平(與未經(jīng)sc-204013處理組比較p<0.05)
5、p38、ERK1/2及JNK1/2抑制劑[SB203580(10μM)、U0126(5μM)、SP600125(90nM)]分別單獨預(yù)處理THP-1細胞,只能部分抑制anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物對TF表達的刺激效應(yīng)(與未經(jīng)抑制劑處理組比較p<0.05);而任意二種抑制劑組合[SB203580(10μM)/U0126(5μM)、U0
8、126(5μM)/SP600125(90nM)、SB203580(10μM)/SP600125(90nM)]預(yù)處理細胞,可以顯著抑制anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激的TF表達(與未經(jīng)抑制劑處理組比較p<0.01)。
結(jié)論:
1、自身抗體/抗原復(fù)合物(anti-β2GPI/β2GPI)刺激單核細胞株THP-1表達TF,細胞內(nèi)的重要信號分子家族MAPKs(p38、ERK1/2及JNK1/2)同時發(fā)生磷酸
9、化反應(yīng)。
2、在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激細胞表達TF所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,細胞表面TLR4及其信號通路分子IRAKs作為MAPKs的上游分子參與調(diào)控作用.提示TLR4-IRAKs-MAPKs通路可作為抗磷脂綜合征(APS)血栓形成的防治靶點。
3、在anti-β2GPI/β2GPI復(fù)合物刺激細胞表達TF的過程中,三種MAPKs分子均發(fā)揮重要作用,并且相互之間的級聯(lián)反應(yīng)存在著復(fù)雜的協(xié)同作用,
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