CSN復(fù)合物在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　全反式維甲酸（ATRA）是第一個(gè)成功應(yīng)用于白血病治療的誘導(dǎo)分化藥物，能夠通過(guò)降解PML-RARα融合蛋白特異性誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）細(xì)胞分化成熟，因此已成為臨床上治療APL的首選藥物。但至今為止，ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化的作用機(jī)制仍未得到系統(tǒng)闡述。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，維甲酸誘導(dǎo)基因G（RIG-G）可與COP9信號(hào)復(fù)合體（CSN）亞基CSN5相互作用，導(dǎo)致CSN復(fù)合物破壞并抑制其功能，提示CSN可能參與ATRA誘導(dǎo)

2、的細(xì)胞分化；但是，其相關(guān)性研究仍未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究將重點(diǎn)研究CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過(guò)程中的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。具體研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分：1）闡明CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過(guò)程中的變化情況；2）研究ATRA誘導(dǎo)分化中CSN-CRLs信號(hào)通路的變化；3）探討CSN-CRLs信號(hào)通路調(diào)控PML-RARα自噬降解的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1）選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，以ATRA處理

3、來(lái)考察ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中CSN的表達(dá)情況：應(yīng)用吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；細(xì)胞經(jīng)CD11b抗體孵育后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)；應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CSN各亞基mRNA水平變化；應(yīng)用Western blot檢測(cè)CSN蛋白水平的變化。同時(shí)應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)11例APL初診患者和15例非血液疾病患者骨髓細(xì)胞中CSN3和CSN5的表達(dá)情況。
　　2）選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，采用We

4、stern blot檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中CSN-CRLs信號(hào)通路中CRLs支架蛋白cullin蛋白、底物識(shí)別蛋白及下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等的表達(dá)情況。
　　3）選用人白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)ATRA誘導(dǎo)分化中細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化；選用293T細(xì)胞為瞬時(shí)表達(dá)宿主，共轉(zhuǎn)染DAPK1和PML-RARα，通過(guò)Western blot檢測(cè)分析DAPK1對(duì)PML-RAR

5、α蛋白的影響；分別以蛋白酶體抑制劑MG132和自噬抑制劑3-MA處理細(xì)胞進(jìn)一步比較觀察PML-RARα蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1）吉姆薩染色結(jié)果表明ATRA作用72小時(shí)后，NB4細(xì)胞分化為成熟粒細(xì)胞。同時(shí)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞分化特異性抗原CD11b的表達(dá)，結(jié)果顯示ATRA能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞發(fā)生分化，且呈時(shí)間依賴(lài)性變化。Western blot及RT-PCR等檢測(cè)結(jié)果顯示，ATRA作用后，CSN復(fù)合物及各亞基表達(dá)水平

6、均明顯下調(diào)，且與細(xì)胞分化進(jìn)程相一致。此外，通過(guò)RT-PCR對(duì)臨床患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSN3和CSN5在APL患者骨髓中的含量明顯高于非白血病患者；經(jīng)ATRA化療緩解后，APL患者的CSN3和CSN5的mRNA表達(dá)水平均明顯下降。進(jìn)一步提示ATRA可以抑制CSN復(fù)合物的表達(dá)。
　　2）鑒于CSN復(fù)合物在泛素蛋白酶體調(diào)節(jié)中的重要作用，進(jìn)一步檢測(cè)CSN-CRLs信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的變化。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ATRA

7、作用后，NB4細(xì)胞中CRLs支架蛋白cullin1和cullin3蛋白及其底物識(shí)別蛋白Skp2、βTrCP與KLHL20的表達(dá)都顯著下降；同時(shí)，其下游靶蛋白DEPTOR、p27與DAPK1表達(dá)明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明CSN-CRLs-E3信號(hào)通路可能在APL發(fā)病以及ATRA誘導(dǎo)分化中發(fā)揮重要作用。
　　3）由于DEPTOR、DAPK1等蛋白分子在細(xì)胞自噬調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，而研究發(fā)現(xiàn)分化誘導(dǎo)劑 ATRA可以增強(qiáng) APL細(xì)胞的自噬水

8、平，并能促進(jìn)PML/RARα蛋白降解。為了探討DAPK1等蛋白的累積是否與ATRA誘導(dǎo)的PML/RARα蛋白的自噬降解有關(guān)，采用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染PML/RARα和DAPK1至293T細(xì)胞，通過(guò)Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示DAPK1的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)PML/RARα蛋白的降解以及增強(qiáng)細(xì)胞自噬；在加入自噬抑制劑3-MA后，細(xì)胞自噬水平下降，同時(shí)DAPK1介導(dǎo)的PML/RARα蛋白降解作用明顯減弱，提示DAPK1可以促進(jìn)PML/RARα蛋白

9、的降解，很可能與其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)本課題的研究，首先，我們發(fā)現(xiàn)CSN在APL患者及NB4細(xì)胞株中呈高表達(dá)；而在ATRA作用后CSN的表達(dá)水平明顯下調(diào)。其次，ATRA通過(guò)調(diào)節(jié)CSN-CRLs信號(hào)通路導(dǎo)致其下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等表達(dá)增加，而DAPK1可以促進(jìn)PML/RARα融合蛋白的自噬降解。本研究較系統(tǒng)地探討了CSN在ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步完善與發(fā)現(xiàn)新的