人脂肪干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中MicroRNA的表達(dá)及細(xì)胞載體復(fù)合物軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究.pdf

1、第一部分人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)及細(xì)胞載體復(fù)合物誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究
　　目的：探討人脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法以及對(duì)細(xì)胞載體復(fù)合物誘導(dǎo)成軟骨分化的研究。
　　方法：通過(guò)選擇性吸脂或其他腹部手術(shù)獲取3個(gè)樣品的脂肪組織，分離、消化獲取人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs），并經(jīng)過(guò)原代和傳代培養(yǎng)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況并繪制hADSCs的生長(zhǎng)曲線；收集第3代hADSCs，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)hADSCs細(xì)胞表面分子標(biāo)志（CD29、CD34、CD4

2、5、CD90和CD105）；hADSCs成脂誘導(dǎo)分化并使用油紅O染色法鑒定，hADSCs成骨誘導(dǎo)分化并使用免疫熒光檢測(cè)骨唾液酸蛋白（BSP）、骨橋蛋白（OPN）、骨連接蛋白（ON）的表達(dá)，利用阿利新藍(lán)染色和免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)正式 hADSCs的成軟骨誘導(dǎo)分化作用；將第3代hADSCs與不同濃度膠原纖維蛋白溶液混合制成細(xì)胞載體復(fù)合物凝膠，14d后進(jìn)行阿利新藍(lán)染色以及免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：體外分離、培養(yǎng)

3、出高活性 hADSCs，增值曲線呈 S形。細(xì)胞CD29、CD90、CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34、CD45呈陰性表達(dá)。hADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈類圓形，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)有透亮的脂滴，油紅 O染色色脂滴呈鮮紅色。成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞呈為不規(guī)則形，免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)骨唾液酸蛋白、骨橋蛋白、骨連接蛋白。hADSCs成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殇伮肥瘶?，阿利新藍(lán)染色細(xì)胞基質(zhì)呈藍(lán)色，免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白染色呈陽(yáng)性。阿利新藍(lán)染色細(xì)胞載體復(fù)合物成藍(lán)色，

4、免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原蛋白結(jié)果顯示，混合膠原蛋白組較單一膠原蛋白組更強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　結(jié)論：成功分離培養(yǎng)出高度同源性hADSCs，具有多分化潛能。膠原纖維蛋白復(fù)合的支架載體，通過(guò)混合培養(yǎng)誘導(dǎo) hADSCs成軟骨細(xì)胞分化，可以作為修復(fù)軟骨缺損的理想載體支架材料。
　　第二部分人脂肪干細(xì)胞軟骨分化過(guò)程中MicroRNA的表達(dá)
　　目的：檢測(cè)人脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中的 MicroRNA（miRNA或者miR）表達(dá)譜，并

5、確認(rèn)該過(guò)程中MicroRNA影響軟骨分化的潛在機(jī)制。
　　方法：（1）通過(guò)選擇性吸脂或其他腹部手術(shù)獲取3個(gè)樣品的脂肪組織，分離和培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）；（2）利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hADSCs表面標(biāo)記物（CD29、CD44、CD49和CD45）；（3）hADSCs經(jīng)過(guò)成軟骨誘導(dǎo)后分化，免疫組化檢測(cè)軟骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)；（4）然后通過(guò)MicroRNA列陣獲得MicroRNA表達(dá)譜，篩選出20個(gè)miRNAs具有至少2倍的差異性

6、表達(dá)，這些miRNA包括12上調(diào)miRNAs和8下調(diào)miRNAs。Northern印跡分析進(jìn)一步證實(shí)了miRNAs的表達(dá)水平，并通過(guò) Northern印跡分析加以證實(shí)；（5）利用 TargetScan（ www.targetscan.org）、MiRanda（ www.microrna.org）和 miRBase（microrna.sanger.ac.uk）等算法預(yù)測(cè) miRNAs的假定靶基因，并利用Western印跡分析檢測(cè)所預(yù)知靶基

7、因，熒光素酶報(bào)告基因分析加以證實(shí)；（6）利用功能分析來(lái)檢測(cè)在 hADSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中miR-196a和miR-490-5p的作用。用miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，并用ELISA量化測(cè)定軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化標(biāo)志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表達(dá)；（7）用BMPR2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hADSCs，并經(jīng)過(guò)向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化孵育后，Western印跡分析檢測(cè)BMPR2蛋白的表達(dá)。ELISA量

8、化測(cè)定軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化標(biāo)志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan）的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）第3代hADSCs是包括小的，單個(gè)圓形或幾個(gè)成團(tuán)懸浮在培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物：細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29，CD44和CD49，陰性表達(dá)CD45；（2）hADSCs經(jīng)軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)呈多邊形（這是軟骨細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征），利用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯升高，證明 hADSCs向軟骨細(xì)胞分化

9、；（3）利用miRNA微陣列芯片進(jìn)行檢測(cè)3組樣品的hADSCs經(jīng)過(guò)軟骨誘導(dǎo)分化前、后的hADSCs的miRNA的表達(dá)水平，軟骨誘導(dǎo)分化前、后差異表達(dá)至少2倍的hADSCs的miRNA，包括12個(gè)上調(diào)miRNA（miR-196a，miR-143，miR-383，miR-193b，miR-7i，miR-26a，miR-539， miR-199a-3p，miR-337-5p，miR-146a-5p，miR-646和 miR-381）和8個(gè)下調(diào)

10、 miRNA（ miR-490-5p， miR-1307， miR-125b， miR-96-3p， miR-302-3p，miR-23a-3p，miR-590和 miR-510）。（4）使用 Northern印跡分析檢測(cè)8個(gè)已利用微列陣證實(shí)了，具有代表性差異性表達(dá)的miRNAs，包括4個(gè)上調(diào)的 miRNAs（miR-196a，miR-193b，miR-383和miR-143）和4個(gè)下調(diào)的miRNAs（miR-490-5p，miR-13

11、07，miR-125b和miR-590）。Northern印跡分析顯示miR-196a在3個(gè)樣品中均過(guò)表達(dá)， miR-490-5p在3個(gè)樣品中均明顯下調(diào)。（5）我們利用功能分析來(lái)檢測(cè)在 hADSCs向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化中這2個(gè) miRNAs（miR-490-5p和miR-196a）的作用。然而，我們僅發(fā)現(xiàn)miR-490-5p在軟骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中具有明顯的作用，miR?196a卻沒(méi)有（數(shù)據(jù)未表明）。但是，在分化的第12天，用 miR-490

12、-5p慢病毒轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞，與對(duì)照慢病毒組比較，到第18天時(shí)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生逆轉(zhuǎn)。我們使用ELISA量化測(cè)定軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化標(biāo)志物（Col2A1, Col10A1 and aggrecan），在第12天，第15天和第18天，細(xì)胞表面標(biāo)記物的水平逐漸上調(diào)；但是，經(jīng)過(guò)miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，這些標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明miR-490-5p抑制hADSCs向軟骨細(xì)胞分化。（6）生物信息學(xué)分析證實(shí)了SOX-2和BMPR2作為miR

13、-490-5p的假定的靶基因，與軟骨細(xì)胞分化有關(guān)。利用 Western印跡分析檢測(cè)所預(yù)知靶基因 SOX-2和 BMPR2的蛋白表達(dá)，結(jié)果表明經(jīng)過(guò)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化的 hADSCs，其 SOX-2和 BMPR2的表達(dá)水平上調(diào)；將這些誘導(dǎo)分化后的 hADSCs用miR-490-5p慢病毒轉(zhuǎn)染后，其BMPR2的表達(dá)水平下調(diào)，而SOX-2的表達(dá)并未受到明顯影響。熒光素酶報(bào)告分析證實(shí)了 miR-490-5p抑制BMPR23'UTR螢光素酶40％的活

14、性，而用突變的BMPR23'UTR轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性被完全逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果說(shuō)明BMPR2是的miR-490-5p的直接靶標(biāo)。（7）用BMPR2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染hADSCs，并經(jīng)過(guò)向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化孵育后，免疫組化檢測(cè)表明BMPR2蛋白表達(dá)以時(shí)間依賴的方式顯著下降，其Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)下調(diào)；ELISA分析發(fā)現(xiàn) Col2A1、Col10A1和aggrecan的表達(dá)水平在第12天，第15天和第18天均下調(diào)。
　　結(jié)論：我們證實(shí)了一組