MIP-1α增加腸屏障通透性及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 腸上皮細(xì)胞的緊密連接是腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，它對(duì)維持上皮細(xì)胞的極性、調(diào)節(jié)腸屏障的通透性發(fā)揮著重要的作用。緊密連接調(diào)節(jié)著離子和大分子物質(zhì)的跨細(xì)胞旁路的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，只允許小分子可溶性物質(zhì)和離子通過(guò)而不允許毒性大分子和微生物通過(guò)，緊密連接一旦發(fā)生改變，腸上皮細(xì)胞(IEC)間隙通透性就會(huì)增加，所以上皮細(xì)胞的完整性對(duì)于保護(hù)腸道的屏障功能及防止微生物進(jìn)入體內(nèi)具有重要的意義，現(xiàn)已證明有多種蛋白質(zhì)參與緊密連接的形成，主要有ZO

2、s、occludin、claudin以及黏附分子等[1-2]。目前認(rèn)為主要起作用的蛋白為ZO-1、occludin、claudin蛋白。
　　 巨噬細(xì)胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1α是C-C趨化因子家族成員之一，對(duì)多種細(xì)胞具有趨化、活化作用[3-4]，是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的一種重要的趨化性細(xì)胞因子，已有研究表明，MIP-1α與很多炎癥性疾病及腫瘤性疾病有密切關(guān)系，

3、但其機(jī)制仍不明確。近年也有研究證明，MIP-1α能抑制蛋白的表達(dá)[5]。MIP-1α還能抑制細(xì)胞進(jìn)入周期和/或降低細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。
　　 近年研究表明很多因素可以導(dǎo)致腸粘膜屏障通透性的增加，主要是通過(guò)緊密連接的改變，本研究旨在加入MIP-1α處理caco-2單層細(xì)胞后腸上皮細(xì)胞緊密連接的改變情況及其影響機(jī)制的闡述。
　　 方法：
　　 1、不同實(shí)驗(yàn)條件下MIP-1α作用于單層caco-2細(xì)胞觀察其對(duì)緊密連接的影響

4、:
　　 (1)利用Transwell方法觀察不同濃度，相同作用時(shí)間、相同濃度不同時(shí)間點(diǎn)MIP-1α作用單層caco-2細(xì)胞后FITC標(biāo)記的Dextran透過(guò)率的情況。
　　 (2)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)選取適合濃度及一定作用時(shí)間，MIP-1α作用于緊密連接，免疫熒光方法觀察其相關(guān)蛋白ZO-1、occludin的變化情況。
　　 2、通過(guò)抑制劑的干擾初步確定相關(guān)的信號(hào)通路
　　 (1)分別利用免疫熒光

5、，western-blot，Transwell的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各種抑制劑預(yù)處理后，50ng/mL MIP-1α與Caco-2細(xì)胞相互作用24小時(shí)后腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1、occludin的變化。
　　 (2)western-blot方法觀察MIP-1α處理后與相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、通透性改變
　　 通過(guò)Transwell結(jié)合免疫熒光的方法觀察到MIP-1α對(duì)單層ca

6、co-2細(xì)胞具有增加其通透性的作用。正常Caco-2細(xì)胞，occludin及Zo-1蛋白沿細(xì)胞膜分布。MIP-1α減少緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，改變occludin蛋白的分布，Zo-1蛋白呈鋸齒狀分布，并且熒光信號(hào)減弱;occludin蛋白向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移，并且在胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性顆粒。
　　 2、加入抑制劑后與對(duì)照組相比
　　 (1)疫熒光可見(jiàn)PD98059、Y27632抑制劑組緊密連接鋸齒狀改變明顯恢復(fù)。LY294002、

7、GO6976抑制劑組未見(jiàn)明顯變化。
　　 (2)Transwell的方法觀察到，F(xiàn)ITC標(biāo)記的dextran的穿過(guò)率，抑制劑LY294002、GO6976實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)率較對(duì)照組未見(jiàn)明顯改變，抑制劑Y27632、PD98059實(shí)驗(yàn)組則明顯降低。
　　 (3) western-blot方法可見(jiàn)緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)與對(duì)照組相比，GO6976、LY294002實(shí)驗(yàn)組明顯降低或者不升高，Y27632、PD98059實(shí)驗(yàn)組明顯升

8、高。
　　 同時(shí)可見(jiàn)occludin蛋白未見(jiàn)明顯變化。Occludin蛋白抽提后，可溶性及不可溶性occludin的表達(dá)，可見(jiàn)Y27632、PD98059組可溶性蛋白增加，不可溶性蛋白明顯減少，說(shuō)明在MIP-1α作用后緊密連接蛋白o(hù)ccludin向胞漿轉(zhuǎn)移。
　　 3、探討MIP-1α處理后幾種信號(hào)蛋白的表達(dá)情況
　　 western-blot方法檢測(cè)到MIP-1α處理后p-cofilin蛋白具有濃度依賴性及時(shí)間