潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜通透性改變及其機(jī)制的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：(1)探討UC患者腸黏膜通透性的改變、腸黏膜通透性反映UC患者疾病活動(dòng)程度的敏感性和腸黏膜通透性改變的MLCK機(jī)制。(2)探討結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的改變、巴柳氮及MLCK抑制劑對(duì)腸黏膜通透性的影響及其MLCK機(jī)制。
　　方法：
　　1.潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜通透性改變及其機(jī)制研究
　　(1)研究對(duì)象
　　收集2009年至2011年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科就診的60例確診為UC的患者和10例對(duì)照者。

2、
　　(2)腸黏膜通透性改變的功能研究
　　UC患者和對(duì)照者測(cè)試前1天晚10時(shí)起禁食,次日早晨6時(shí)空腹排空尿液后,口服乳果糖和甘露醇測(cè)試液50ml,口服測(cè)試液后禁水1小時(shí),禁食2小時(shí),收集口服乳果糖和甘露醇后6h內(nèi)尿液標(biāo)本,防腐處理后,置-80℃保存。采用HPLC-PED方法檢測(cè)UC患者和對(duì)照者口服乳果糖(L)和甘露醇(M)測(cè)試液后尿液中L、M含量,計(jì)算L/M比值。分析UC患者腸黏膜通透性的功能改變。
　　(3)腸黏膜

3、通透性改變的形態(tài)學(xué)研究
　　UC患者和對(duì)照者結(jié)腸鏡檢查時(shí),進(jìn)境至末段回腸,通過活檢鉗取距回盲瓣5cm處回腸黏膜標(biāo)本4-6塊,分別置于電鏡固定液、10％甲醛固定液和液氮中備測(cè)。采用透射電鏡檢測(cè)小腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,分析腸黏膜通透性改變的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　(4)腸黏膜通透性改變與臨床指標(biāo)間相關(guān)分析
　　UC患者入院時(shí)采集血標(biāo)本分別檢測(cè)ESR、CRP,同時(shí)進(jìn)行Sutherland DAI評(píng)分,分析腸黏膜通透性和ESR

4、、CRP、Sutherland DAI評(píng)分之間的相關(guān)性,探討腸黏膜通透性反映UC患者疾病活動(dòng)程度的敏感性。
　　(5)腸黏膜通透性改變的MLCK機(jī)制研究
　　在研究腸黏膜通透性改變的功能和形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)上,收集UC患者和對(duì)照者回腸末段標(biāo)本,采用免疫組化、Western blotting和ELISA法檢測(cè)MLCK活性和表達(dá)。分析UC患者腸黏膜通透性的改變與MLCK之間的相關(guān)性,探討腸黏膜通透性的MLCK機(jī)制。
　　2.巴

5、柳氮對(duì)結(jié)腸炎小腸腸黏膜通透性的影響及其機(jī)制研究
　　(1)建立小鼠結(jié)腸炎模型和分組給藥
　　將45只C57BL/6J小鼠用隨機(jī)方法分成5組:正常對(duì)照組、DSS模型組、巴柳氮低劑量組、巴柳氮中劑量組、巴柳氮高劑量組。正常對(duì)照組自由飲水, DSS模型組、巴柳氮3個(gè)劑量組從實(shí)驗(yàn)第1天開始自由飲用5%DSS溶液,共7天。巴柳氮給藥劑量根據(jù)小鼠體重計(jì)算,分別為42 mg/kg、141 mg/kg、423 mg/kg,巴柳氮用蒸餾水溶解

6、后灌胃給藥,正常對(duì)照組和DSS模型組用等量蒸餾水灌胃,給藥時(shí)間共7天。
　　(2)結(jié)腸炎動(dòng)物模型評(píng)估
　　每日觀察小鼠體重變化、大便性狀、觀察或用糞便隱血試紙檢測(cè)大便帶血情況,進(jìn)行DAI評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取結(jié)腸進(jìn)行HE染色評(píng)分,結(jié)腸勻漿檢測(cè)MPO、SOD、GSH-Px活性和MDA含量。
　　(3)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性評(píng)估
　　從腸黏膜通透性改變的功能和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上同時(shí)進(jìn)行分析,對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變功能研究

7、,采用 Evans藍(lán)方法同時(shí)檢測(cè)小腸黏膜通透性。對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變的形態(tài)學(xué)研究,采用透射電鏡檢查小腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,并采用免疫組化檢測(cè)E-鈣粘蛋白的表達(dá)。
　　(4)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變的機(jī)制
　　在評(píng)估結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的基礎(chǔ)上,采用 ELISA方法檢測(cè)小腸勻漿TNF-α和IFN–γ含量。采用免疫組化檢測(cè)E-鈣粘蛋白和VCAM-1蛋白的表達(dá)。
　　3.MLCK抑制劑對(duì)結(jié)腸炎小腸腸黏膜通透

8、性的影響及其機(jī)制研究
　　(1)建立小鼠結(jié)腸炎模型和分組給藥
　　將24只C57BL/6J小鼠用隨機(jī)方法分成3組:正常對(duì)照組、DSS模型組、MLCK抑制劑組。正常對(duì)照組自由飲水,DSS模型組、MLCK抑制劑組從實(shí)驗(yàn)第1天開始自由飲用5%DSS溶液,共7天。MLCK抑制劑(ML-72 mg/kg)用生理鹽水(NS)溶解后腹腔內(nèi)注射給藥,每天2次。正常對(duì)照組和DSS模型組用等量NS腹腔內(nèi)注射。
　　(2)結(jié)腸炎動(dòng)物模型評(píng)估

9、
　　每日觀察小鼠體重變化、大便性狀、觀察或用糞便隱血試紙檢測(cè)大便帶血情況,進(jìn)行DAI評(píng)分。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取結(jié)腸進(jìn)行HE染色評(píng)分,結(jié)腸勻漿檢測(cè)MPO活性、TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平。
　　(3)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性評(píng)估
　　從腸黏膜通透性改變的功能和形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上同時(shí)進(jìn)行分析,對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變功能研究,采用體內(nèi)試驗(yàn) FITC-4000和體外試驗(yàn) Evans藍(lán)方法同時(shí)檢測(cè)小腸黏膜通透性。對(duì)

10、結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變的形態(tài)學(xué)研究,采用透射電鏡檢查小腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　(4)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變的MLCK機(jī)制
　　在評(píng)估結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的基礎(chǔ)上,采集小腸標(biāo)本,分別采用Western blotting、免疫組化、ELISA等不同方法檢測(cè)MLCK表達(dá)和活性。分析腸黏膜通透性改變與MLCK表達(dá)和活性的關(guān)聯(lián)。
　　結(jié)果：
　　1.潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜通透性改變及其機(jī)制研究
　

11、　(1) UC患者腸黏膜通透性功能的改變HPLC方法測(cè)定結(jié)果
　　60例UC患者尿中L/M比值為0.081±0.068,明顯高于10例對(duì)照者尿中L/M比值(0.020±0.002,P<0.05),表明UC患者腸黏膜通透性明顯增高。
　　(2)UC患者腸黏膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變
　　與對(duì)照組比較,UC患者回腸黏膜絨毛排列不規(guī)則,細(xì)胞間隙擴(kuò)大。提示UC患者腸黏膜上皮屏障結(jié)構(gòu)損害。
　　(3)UC患者腸黏膜通透性改變與

12、臨床指標(biāo)間相關(guān)性分析
　　60例患者L/M比值和Sutherland DAI評(píng)分之間呈正相關(guān)(r=0.634),其中全結(jié)腸型UC患者,尤全結(jié)腸重度UC患者L/M比值和Sutherland DAI評(píng)分之間相關(guān)性更高,相關(guān)系數(shù)分別為0.639、0.703,表明腸黏膜通透性的改變和UC患者疾病活動(dòng)程度呈一致性,并且病變范圍和病情嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　(4)UC患者回腸上皮細(xì)胞MLCK蛋白表達(dá)和酶活性
　　UC患者回腸上皮細(xì)胞M

13、LCK蛋白表達(dá)及MLCK活性明顯高于對(duì)照者。UC患者L/M比值和MLCK酶活性之間呈正相關(guān)(r=0.846),表明腸黏膜通透性的改變和回腸上皮細(xì)胞MLCK酶活性程度一致,提示MLCK可能參與UC患者腸黏膜通透性調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　2.巴柳氮對(duì)結(jié)腸炎小腸腸黏膜通透性的影響及其機(jī)制研究
　　(1)結(jié)腸炎小鼠模型的建立
　　C57BL/6J小鼠自由飲用5%DSS溶液1周后出現(xiàn)明顯體重減輕、便血和腹瀉, DAI評(píng)分和HI評(píng)分增高(

14、P<0.01),同時(shí)結(jié)腸黏膜MPO活性明顯增高(P<0.05)。正常對(duì)照組小鼠體重?zé)o明顯減輕、大便性狀正常,DAI評(píng)分、HI評(píng)分和結(jié)腸黏膜MPO活性均無明顯增高。
　　(2)巴柳氮的抗結(jié)腸炎作用
　　巴柳氮組小鼠一般情況明顯改善,DAI評(píng)分和HI評(píng)分與DSS模型組小鼠相比,明顯降低(P<0.05),結(jié)腸黏膜MPO活性減低。DSS模型組小鼠和正常對(duì)照組相比, SOD、GSH-Px活性明顯降低,MDA含量明顯增高(P<0.05)

15、。巴柳氮組SOD、GSH-Px活性增高,MDA含量明顯降低(P<0.05)。
　　(3)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性的改變
　　DSS模型組小鼠和正常對(duì)照組相比,腸組織中Evans藍(lán)含量明顯增加(P<0.05),表明結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性增高。透射電鏡檢查DSS模型組小鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)改變,絨毛變短、萎縮、稀疏、排列極不規(guī)則,細(xì)胞間連接復(fù)合體縮短、變寬,細(xì)胞間隙擴(kuò)大。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白表達(dá)減少。與DSS模型組相比,

16、巴柳氮組組小鼠腸組織中Evans藍(lán)含量明顯降低(P<0.05),表明結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改善?；啬c黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改善,絨毛排列整齊、密集,細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)清晰、緊密程度增高,E-鈣粘蛋白表達(dá)增強(qiáng)。
　　(4)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改變的機(jī)制
　　DSS模型組小鼠和正常對(duì)照組相比,小腸勻漿TNF-α和IFN-γ水平明顯增高(P<0.05)。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)小腸黏膜上皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)增強(qiáng)。巴柳氮組小腸TNF-α和IFN

17、-γ水平明顯降低(P<0.05),小腸黏膜上皮細(xì)胞VCAM-1蛋白表達(dá)減少。
　　3. MLCK抑制劑對(duì)結(jié)腸炎小腸腸黏膜通透性的影響及其機(jī)制研究
　　(1)結(jié)腸炎小鼠模型的建立
　　C57BL/6J小鼠自由飲用5%DSS溶液1周后出現(xiàn)明顯體重減輕、便血和腹瀉, DAI評(píng)分和HI評(píng)分增高(P<0.05),同時(shí)結(jié)腸黏膜MPO活性明顯增高(P<0.05)。正常對(duì)照組小鼠體重?zé)o明顯減輕、大便性狀正常,DAI評(píng)分、HI評(píng)分和結(jié)腸

18、黏膜MPO活性均無明顯增高。
　　(2)MLCK抑制劑的抗結(jié)腸炎作用
　　MLCK抑制劑組小鼠一般情況明顯改善,DAI評(píng)分和HI評(píng)分與DSS模型組小鼠相比,明顯降低(P<0.05),結(jié)腸黏膜MPO活性減低。DSS模型組小鼠和正常對(duì)照組相比,TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平明顯增高(P<0.05)。MLCK抑制劑組TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平明顯降低(P<0.05)。
　　(3)結(jié)

19、腸炎小鼠腸黏膜通透性的改變
　　DSS模型組小鼠和正常對(duì)照組相比,血液中FITC-4000含量和腸組織中Evans藍(lán)含量明顯增加(P<0.05),表明結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性增高。透射電鏡檢查DSS模型組小鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)改變,絨毛變短、稀疏、排列不規(guī)則,細(xì)胞間連接復(fù)合體縮短、變寬,細(xì)胞間隙擴(kuò)大。免疫組化及ELISA方法發(fā)現(xiàn)MLCK蛋白表達(dá)增強(qiáng)、酶活性增高。與DSS模型組相比,MLCK抑制劑組小鼠血液中FITC-4000含量和

20、腸組織中Evans藍(lán)含量明顯降低(P<0.05),表明結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性改善。回腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改善,絨毛排列整齊、密集,細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)清晰、緊密程度增高,MLCK蛋白表達(dá)減少、酶活性減低。
　　結(jié)論
　　(1)UC患者和對(duì)照者相比,腸黏膜通透性明顯增高。采用HPLC方法測(cè)定口服乳果糖和甘露醇測(cè)試液后尿液中乳果糖/甘露醇排出比值,能正確地反映患者腸黏膜通透性的改變。
　　(2)UC患者腸黏膜通透性的改變和UC患

21、者疾病活動(dòng)程度呈一致性,并且與病變范圍和病情嚴(yán)重程度有關(guān)。腸黏膜通透性的改變反映UC疾病活動(dòng)程度的敏感性高于ESR、CRP。
　　(3)UC患者腸黏膜通透性的改變和回腸上皮細(xì)胞MLCK酶活性程度一致,提示MLCK可能參與UC患者腸黏膜通透性調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　(4)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠臨床表現(xiàn)、病理特征與UC相似,是UC發(fā)病機(jī)制和臨床藥物研究比較理想的動(dòng)物模型。
　　(5)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜通透性增高,小腸促炎性細(xì)胞因子表