白花丹參HDR基因的克隆和功能分析及無抗生素篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、丹參是一味重要的傳統(tǒng)的中草藥，被廣泛應(yīng)用于各種心血管疾病的治療。白花丹參（Salvia miltiorrhiza bge.f.alba C.Y.WU et H.W.Li）是紫花丹參的變種，山東特產(chǎn)藥材之一。作為一個新品種已被列入《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2000年版)。白花丹參與丹參具有基本相同的化學(xué)成分，含有脂溶性成分丹參酮類和可溶性酚酸成分，可作為丹參代替品。白花丹參主要生長在山東省的泰山周邊，由于丹參活性成分在其植物含量較低，生長周期

2、較長，再加上近年來由于環(huán)境惡化和過度采挖，加速了白花丹參的減產(chǎn)，還有環(huán)境的污染和農(nóng)藥使用等原因?qū)ΨN植產(chǎn)地的影響，白花丹參的數(shù)量和質(zhì)量不能滿足臨床應(yīng)用的需要。借助于植物基因工程和組織細(xì)胞工程相結(jié)合的生物方法，可以為這些藥用活性成分生產(chǎn)提供有效的途徑。
　　我們從構(gòu)建的白花丹參兩年生根的cDNA文庫中分離到1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate reductase(HDR)基因全長

3、，并對其功能進(jìn)行了分析。HDR是植物MEP代謝途徑的最后一個酶，命名為白花丹參HDR的SmHDR1(Genbank Accession Number JX516088)，包含1，389-bp的ORF，編碼463個氨基酸。推測的SmHDR1蛋白，與其他植物物種的HDRs具有很高的同源性,N-端具有一個質(zhì)體信號肽片段，同時還具有4個保守的Cys殘基。轉(zhuǎn)錄模式分析表明SmHDR1在葉片表達(dá)最高，在根部和莖部表達(dá)較低。在白花丹參毛狀根里，0.1

4、 mM methyl-jasmonate(MeJA)和salicylic acid(SA)可以明顯誘導(dǎo)SmHDR1表達(dá)量增高，但是對Abscisic acid(ABA)誘導(dǎo)不敏感。在大腸桿菌HDR突變體E.coli HDR mutant MG1655 ara<>ispH里表達(dá)SmHDR1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmHDR1可以互補細(xì)菌HDR，具有HDR酶活性;在大腸桿菌TOP10F'里同時表達(dá)胡蘿卜素合成基因和SmHDR1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SmHDR1可以促

5、進(jìn)胡蘿卜素的合成，說明SmHDR參與了細(xì)菌胡蘿卜素生物合成途徑，是一個有活性的功能蛋白。在白花丹參毛狀根里過表達(dá)SmHDR1，也表明SmHDR1可以促進(jìn)丹參丹參酮的生物合成。以上結(jié)果說明SmHDR1是一個新的、很重要的參與白花丹參丹參酮生物合成的關(guān)鍵酶。
　　本研究還首次構(gòu)建了以PMI基因作為安全篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化白花丹參，以期建立起具有生物安全性的白花丹參轉(zhuǎn)基因體系，為白花丹參的遺傳改良提供技術(shù)資料。
　　

6、首先從大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α中克隆6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶（6-phosphomannose isomerase，PMI）基因，然后以PMI基因替換植物表達(dá)載體pCAMBIA1305中的hyg基因，構(gòu)建了以PMI基因為選擇標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1305-PMI，并用電擊轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中，用葉片浸染法轉(zhuǎn)化白花丹參。在白花丹