將軍菊苣DREB家族基因的克隆、功能研究及其遺傳轉化體系的建立.pdf

1、干旱、高溫、低溫和高鹽是嚴重影響作物生長發(fā)育及產(chǎn)量的環(huán)境脅迫因子。逆境響應轉錄因子通過順式元件及其它相關蛋白之間的相互作用，可激活或抑制下游一系列抗逆功能基因的轉錄，從而提高植物的綜合抗逆性，這在抗逆轉基因育種中具有重要研究價值。植物中AP2家族的DREB類轉錄因子是近年來抗逆分子育種研究的熱點，該類基因對提高植物的綜合抗逆性具有重要科學意義和應用價值。
　　菊苣是我國重要的藥食兩用植物，是菊糖的主要來源。近幾年已逐步取得了一些可

2、喜進展，但對其基因研究進展仍然比較緩慢。利用現(xiàn)代基因工程技術進行菊苣的品種改良是當前菊苣育種的一個新方向，它可以打破生殖隔離，使得不同物種間遺傳交流成為可能，為拓寬植物可利用基因庫創(chuàng)造條件，彌補了常規(guī)雜交育種的不足，加速了作物遺傳育種的發(fā)展。
　　本研究以將軍菊苣為為材料，從菊苣中分離克隆了三條DREB類轉錄基因，并對其進行功能分析，同時建立農桿菌介導的將軍菊苣遺傳轉化體系，為利用基因工程的方法改良菊苣的抗逆性提供基礎。主要結果如

3、下:
　　1.利用其他物種已經(jīng)驗證過功能的DREB類轉錄因子CDS序列，以及菊苣現(xiàn)有的EST數(shù)據(jù)庫，通過電子克隆、RACE等技術手段克隆獲得三條DREB類基因。序列分析表明這三個基因具有DREB轉錄因子所特有的功能結構域。序列比對表明三個基因和其他已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP結構域處具有很高的同源性外，在其它區(qū)域的序列同源性不高。對將軍菊苣材料進行各種脅迫處理(干旱、高鹽、低溫和ABA)，運用熒光定量PCR技術

4、對DREB轉錄因子進行基因表達特性分析。結果表明，這三個CiDREB基因在菊苣植株對干旱、高鹽、高溫、低溫和ABA的應答反應中起重要作用。CiDREB2不受干旱脅迫，主要對高溫脅迫產(chǎn)生響應，ABA、低溫、高鹽也能誘導其表達量上升;CiDREB5受高溫、低溫和干旱誘導，而不受高鹽的誘導，且參與不依賴ABA的調控途徑;CiDREB6主要受高溫和干旱強烈誘導，不受低溫和高鹽誘導，并且該基因在葉中的表達量比根中，且受高鹽和干旱強烈誘導。

5、　　2.利用酵母單雜交的方法，將CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6基因cDNA的編碼區(qū)插入到酵母表達載體pGART7-AD中，將其分別轉化到含有不同DRE元件報告質粒的酵母菌株中，觀測轉化的重組酵母菌株在SD/-Leu/-Trp/-His+40mM3-AT選擇培養(yǎng)基上的生長情況。試驗結果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6都具有特異結合DRE元件的活性，并且DRE核心序列兩端序列對其識別特異性有影響。把目的基

6、因插入到35S啟動子和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因之間，構建CiDREB轉錄因子的亞細胞定位重組載體。通過基因槍法轉化洋蔥表皮細胞，暗培養(yǎng)12h后共聚焦顯微鏡下觀察，驗證CiDREB是否具有核定位功能。研究結果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6蛋白都可以在細胞核內產(chǎn)生EGFP的綠色熒光，說明這三個基因屬于轉錄因子類基因，能夠入核行使功能。
　　3.以將軍菊苣子葉為材料，通過植物組織培養(yǎng)的方法，探討了不同激素

7、濃度配比對愈傷組織誘導、芽分化以及根再生的影響，并通過農桿菌介導法將編碼獐茅液泡膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因(AINHX)導入將軍菊苣中，建立農桿菌介導的將軍遺傳轉化體系。結果表明:將軍菊苣愈傷組織誘導和芽分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/LNAA。獲得的抗性芽經(jīng)PCR檢測，初步證實AINHX已插入到菊苣基因組中，統(tǒng)計得將軍菊苣轉化效率為13.3％。