蘿鞭木MCT、HDS、SGD基因的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、蘿芙木(Rauvolfia verticillata L.)是一類(lèi)重要的生產(chǎn)萜類(lèi)吲哚生物堿(Terpenoid indoleAlkolids，TIAs)的夾竹桃科木本植物，如今已經(jīng)從其中分離到了超過(guò)90種生物堿，包括治療高血壓的阿瑪堿、利血平，以及治療男性不育和動(dòng)脈硬化的育亨賓等。但天然藥源蘿芙木中生物堿的含量很低，目前蘿芙木的生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足國(guó)際市場(chǎng)的需求。化學(xué)合成阿瑪堿、利血平等生物堿成本高、毒性大，所以不能應(yīng)用于生產(chǎn)。近年來(lái)，隨著

2、萜類(lèi)吲哚生物堿生物合成途徑相關(guān)酶基因的克隆，基因工程成為提高阿瑪堿含量的有效途徑之一。為了研究阿瑪堿生物合成的分子機(jī)理和為萜類(lèi)吲哚生物堿代謝工程提供新的靶點(diǎn)，本研究采用RACE技術(shù)從蘿芙木中首次克隆獲得了阿瑪堿合成途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶基因：2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶(2-C-Methyl-D-erythritol4-phosphate cytidyltransferase，MCT：EC：2.7.7.60)基因、羥甲基丁

3、烯基-4-磷酸合成酶(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase，HDS；EC：1.17.4.3)基因和異胡豆苷-β-D-糖苷酶(scrictosidine-β-glucosidase，SGD：EC：3.2.1.105)基因，并進(jìn)行了相應(yīng)的生物信息學(xué)分析。此外，本研究還建立了蘿芙木的高效再生體系和發(fā)根遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而為在蘿芙木中開(kāi)展代謝工程研究奠定了基礎(chǔ)。
　　

4、 MCT是甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑途徑上的第三個(gè)酶，催化2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸和CDP縮合成4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤蘚醇(4-(cytidine5-diphospho)-2-C-methylerythritol，CDP-ME)。本研究采用RACE技術(shù)，從蘿芙木中克隆了MCT基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為RvMCT(GenBank登錄號(hào)為：JF966732)。生物信息學(xué)分析表明，該基因cDNA

5、全長(zhǎng)1524 bp，包含945 bp的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼314個(gè)氨基酸殘基蛋白質(zhì)，其理論分子量為34.45 kDa，等電點(diǎn)為7.34，TargetP軟件預(yù)測(cè)其N(xiāo)端存在質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析顯示，RvMCT蛋白與其它物種的MCT蛋白具有同源性，尤其與植物來(lái)源的MC工具有高度同源性，與長(zhǎng)春花(Catharanthus roseus)MCT似性達(dá)到了84.1％。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)RvMCT

6、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)由52.87％的隨意卷曲、15.61％的片層和31.53％的α-螺旋組成。將RvMCT與來(lái)源于植物、細(xì)菌的MCTs構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明MCTs在進(jìn)化樹(shù)上按照各自所屬類(lèi)群分為3大枝：細(xì)菌、裸子植物和被子植物，RvMCT聚到被子植物的一枝，且與長(zhǎng)春花MCT親緣關(guān)系最接近。利用熒光定量PCR對(duì)RvMCT進(jìn)行組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明RvMCT在嫩葉中的表達(dá)量最高，其次是老葉、樹(shù)皮、根和莖。
　　 HDS催化2-C-甲基赤

7、蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸(ME-cPP)轉(zhuǎn)化生成羥甲基丁烯基-4-磷酸(HMBPP)，是MEP途徑中的倒數(shù)第二個(gè)酶。本研究采用RACE技術(shù)，從蘿芙木中克隆獲得了HDS基因的全長(zhǎng)cDNA，并命名為RvHDS(GenBank登錄號(hào)為：HQ659759)。該基因cDNA全長(zhǎng)2645 bp，包含2223 bp的開(kāi)放式閱讀框，編碼740個(gè)氨基酸殘基的蛋白，其電子預(yù)測(cè)分子量為82 kDa，等電點(diǎn)預(yù)測(cè)為6.28。生物信息學(xué)分析顯示，RvHDS與來(lái)源于其

8、他物種的HDS蛋白序列同源，尤其是與植物來(lái)源的HDS高度同源，在N端有質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。RvHDS序列包含HDS蛋白典型的Cys-270、Cys-273、Cys-305氨酸殘基活性位點(diǎn)，這三個(gè)氨基酸殘基被認(rèn)為是HDS蛋白催化區(qū)域中最保守的三個(gè)位點(diǎn)。對(duì)來(lái)源于不同物種中的HDSs構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)表明，HDSs在進(jìn)化樹(shù)上聚為3枝，RvHDS聚到植物的一枝且與長(zhǎng)春花HDS的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果表明RvHDS在老葉中表達(dá)量最高，其次是樹(shù)皮、嫩葉、

9、根和莖。
　　 SGD催化TIAs合成途徑中的通用前體異胡豆苷進(jìn)行去糖基化反應(yīng)，此步反應(yīng)促使了TIAs在不同物種中的多樣性。本研究采用RACE技術(shù)，從蘿芙木中克隆獲得了SGD的全長(zhǎng)cDNA，并命名為RvSGD(GenBank登錄號(hào)為：JF966733)。該基因cDNA全長(zhǎng)1859bp，包含1608bp的開(kāi)放閱讀框，編碼536個(gè)氨基酸，其電子預(yù)測(cè)分子量為61 kDa，等電點(diǎn)pI為6.16。生物信息學(xué)分析顯示，RvSGD與蛇根木SG

10、D及長(zhǎng)春花SGD的序列相似性分別高達(dá)90.1％和70.9％，RvSGD也具有SGD蛋白的三個(gè)保守的氨基酸催化位點(diǎn)His-161，Glu-207和Glu-419。熒光定量PCR表明RvSGD在樹(shù)皮中表達(dá)量最高，其次是老葉、根、嫩葉和莖。對(duì)RvMCT、RvHDS和RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解這三個(gè)基因在TIAs的生物合成中的作用，并為今后調(diào)控TIAs的生物合成提供了新的靶點(diǎn)。
　　 隨著基因克隆及生物合

11、成途徑的闡明，代謝工程被認(rèn)為是提高萜類(lèi)吲哚生物堿含量的有效途徑。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得高產(chǎn)TIAs的轉(zhuǎn)基因植株或發(fā)根從而解決TIAs原料短缺是一種可行的方法。然而轉(zhuǎn)基因工作的進(jìn)行必須依賴(lài)于植物高效再生體系的建立或毛狀根遺傳體系的建立，蘿芙木是一種木本植物，再生和遺傳轉(zhuǎn)化相對(duì)困難。為了給后續(xù)開(kāi)展蘿芙木轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)，本文對(duì)蘿芙木植株再生體系和發(fā)根轉(zhuǎn)化體系分別進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，以蘿芙木莖段作為外植體，先在添加了0.8 mg/L IBA