黑粉菌菌絲形成相關(guān)基因的分離和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、格氏梅拉菌是一種擔(dān)子菌類酵母樣無(wú)性態(tài)真菌，屬于黑粉菌綱外擔(dān)子菌亞綱。本研究室從毛竹種子分離出兩株新的格氏梅拉菌菌株（PM1和PM2），觀察到PM1和PM2具有不同的菌落形態(tài)，顯微鏡下觀察PM1只能形成很短的胞鏈，而PM2形成帶有分支的完整菌絲。由于菌絲的形成往往和真菌侵染寄主的能力相關(guān)，本研究進(jìn)一步采用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建兩個(gè)格氏梅拉菌的差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，分離出菌絲形成相關(guān)基因片段。并以黑粉菌研究模型玉米黑粉菌為對(duì)象，構(gòu)建了一個(gè)根癌

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系。針對(duì)消減文庫(kù)獲得的cDNA片段，設(shè)計(jì)了一系列載體進(jìn)行格氏梅拉菌表達(dá)基因抑制研究。取得了以下主要研究成果:
　　1.構(gòu)建了菌絲形態(tài)差異的兩個(gè)格氏梅拉菌的正向和反向消減cDNA文庫(kù)，每個(gè)文庫(kù)都得到上千菌落。從PM1消減PM2文庫(kù)中挑選測(cè)序后得到10條EST序列，經(jīng)過(guò)同源性分析有7個(gè)片段與其它真菌基因具有較高的相似性。其中包括了真菌菌絲形成或者真菌形態(tài)相關(guān)的蛋白，如熱休克蛋白、錳超氧化物歧化酶、泛素-核糖體蛋白、核

3、糖體蛋白，推測(cè)這些基因表達(dá)差異可能影響了格氏梅拉菌菌絲的形成和菌株的致病性。
　　2.建立和優(yōu)化了簡(jiǎn)單高效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米黑粉菌轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮、誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基的pH值、共培養(yǎng)溫度、農(nóng)桿菌濃度等因素與轉(zhuǎn)化效率有關(guān)。當(dāng)農(nóng)桿菌用200uM乙酰丁香酮誘導(dǎo)6h之后搖床培養(yǎng)至OD6000.5，黑粉菌培養(yǎng)至OD6000.5時(shí)，各取100ul菌液在pH5.3的共培養(yǎng)基上22℃培養(yǎng)2天之后，轉(zhuǎn)化效率最高。該轉(zhuǎn)化體系不僅針對(duì)玉米黑粉菌

4、，而且能夠用于其它黑粉菌類如大麥堅(jiān)黑粉菌等的轉(zhuǎn)化，也為下一步結(jié)合差減cDNA文庫(kù)在格氏梅拉菌中進(jìn)行基因表達(dá)抑制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.構(gòu)建了一系列黑粉菌通用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體。以PPK2載體為骨架，通過(guò)Clontech的In-Fusion(R) PCR技術(shù)，擺脫酶切位點(diǎn)的限制，能夠自由選擇不同類型的真菌啟動(dòng)子和真菌抗性基因，構(gòu)建一套方便多樣的農(nóng)桿菌表達(dá)和干涉載體。
　　本研究取得的結(jié)果為進(jìn)一步開展格氏梅拉菌和大麥黑粉菌等黑粉菌