臨床銅綠假單胞菌的毒力性能及穿心蓮內(nèi)酯對(duì)其的干預(yù)作用研究.pdf

1、第一部分、臨床銅綠假單胞菌生物膜形成的分析
　　目的:分析不同來(lái)源的臨床銅綠假單胞菌生物膜形成能力。
　　方法:選擇源自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（49株），北京大學(xué)附屬第一醫(yī)院（14株）和浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院（32株）三家醫(yī)院的臨床銅綠假單胞菌共95株，其中痰液標(biāo)本49株，血液標(biāo)本30株，腹腔膿液、尿液、膽汁及其他來(lái)源標(biāo)本共計(jì)16株。微量滴定板生物膜分析實(shí)驗(yàn)測(cè)定生物膜的成熟期及其形成能力的強(qiáng)弱;綜合臨床菌株的不同來(lái)源及生物膜

2、形成能力，分析兩者的相關(guān)性。
　　結(jié)果:所有不同來(lái)源的臨床銅綠假單胞菌株均可以形成生物膜。49株分離自痰液的銅綠假單胞菌中有45株的生物膜形成能力強(qiáng)(91.8％)，46株分離自血液、腹腔膿液、尿液、膽汁及其他來(lái)源的菌株中生物膜形成能力強(qiáng)的有33株(71.7％);痰液來(lái)源和非痰液來(lái)源的臨床菌株的生物膜形成能力強(qiáng)的菌株比率相比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。49株痰液來(lái)源的菌株生物膜到達(dá)成熟期的時(shí)間為3.63±1.20天，46

3、株非痰液來(lái)源的菌株生物膜到達(dá)成熟期的時(shí)間為為4.27±1.23天，痰液組和非痰液組的生物膜成熟期形成時(shí)間進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:不同臨床分離銅綠假單胞菌株形成生物膜的能力差異較大。痰液來(lái)源的臨床菌株較非痰液來(lái)源的臨床菌株生物膜形成能力強(qiáng)，且痰液來(lái)源的臨床菌株較非痰液來(lái)源的臨床菌株到達(dá)生物膜成熟期所需的時(shí)間短。
　　第二部分、穿心蓮內(nèi)酯對(duì)臨床銅綠假單胞菌感染人支氣管上皮細(xì)胞的影響
　　目的

4、:制備銅綠假單胞菌感染人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)模型，研究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)細(xì)菌感染性和其誘發(fā)宿主細(xì)胞炎性反應(yīng)能力的影響。
　　方法:選擇源自重慶、北京和浙江三家醫(yī)院的臨床銅綠假單胞菌，采用聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)各臨床菌株T3SS毒力效應(yīng)分子的編碼基因。根據(jù)其毒力效應(yīng)分子編碼基因的攜帶差異，選擇Cq40（exoU+、exoS-、exo T+和exoY+）、Cq1（exo

5、U-、exoS+、exoT+和exoY+）、Cq24(exoU-、exoS+、exoT-和exoY+)及Cq16(exoU+、exoS-、exoT-和exoY+)四株臨床菌株，分別用于感染人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B。菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)銅綠假單胞菌對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的侵襲力;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)銅綠假單胞菌感染BEAS-2B細(xì)胞后乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)的釋放量及炎癥因子白介素-6（

6、Interleukin-6，IL-6）和IL-8（Interleukin-8，IL-8）的表達(dá)水平。用Luria-Bertani broth肉湯(LB肉湯)培養(yǎng)基，觀察穿心蓮內(nèi)酯（濃度300μM）對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。用不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(3μM和4.5μM)干預(yù)銅綠假單胞菌感染BEAS-2B，菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)干預(yù)后銅綠假單胞菌對(duì)BEAS-2B細(xì)胞的侵襲力;用ELISA法檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)BEAS-2B后LDH的釋放量及炎癥因子IL-6和I

7、L-8的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:95株分離自臨床的銅綠假單胞菌T3SS毒力基因的攜帶率分別為exoU21％、exoS84.2％、exoT49.5％和exoY82.1％，重慶組(49株)中，20％攜帶exoU，90％攜帶exoS，59％攜帶exoT,攜帶91.8％ exoY。杭州組（32株）中，28％攜帶exoU，69％攜帶exoS,25％攜帶exoT,63％攜帶exoY。北京組（14株）中7％攜帶exoU,100％攜帶exoS,71

8、％攜帶exoT,93％攜帶exoY。將單個(gè)菌株進(jìn)行毒力效應(yīng)分子編碼基因攜帶分型，可分為11種類型，其中exoU-、exoS-、exoT-和exoY-9株，只含exoU-、exoS+、exoT-和exoY-4株，含exoU-、exoS+、exoT+和exoY-4株，exoU-、exoS+、exoT-和exoY+28株，exoU-、exoS-、exoT+和exoY+2株，exoU-、exoS+、exoT+和exoY+29株，exoU+、ex

9、oS-、exoT-和exoY+02株，exoU+、exoS-、exoT+和exo Y+2株，exo U+、exoS+、exoT+和exoY-2株，exoU+、exoS+、exoT-和exoY+5株，以及exoU+、exoS+、exoT+和exo Y+8株。95株臨床銅綠假單胞菌的毒力基因攜帶以exoU-、exoS+、exoT-、exo Y+和exoU-、exoS+、exoT+、exo Y+兩種類型為主。痰液組中exoU-、exoS+、e

10、xoT+、exo Y+基因型攜帶率33％，非痰液組為30％，exoU-、exoS+、exoT-、exoY+基因型在痰液組攜帶率為37％，在非痰液組攜帶率為22％。兩種基因型攜帶率在痰液組和非痰液組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。Cq40、Cq1、Cq24及Cq16等四株臨床菌株銅綠假單胞菌能侵入細(xì)胞，3μM穿心蓮內(nèi)酯就能顯著降低侵入胞內(nèi)的銅綠假單胞菌數(shù): Cq1組菌落數(shù)由1840±121CFU/ml降至1090±101CFU/ml; C

11、q40組菌落數(shù)由2900±100CFU/ml降至1060±196 CFU/ml; Cq16組菌落數(shù)由3200±264CFU/ml降至1090±125 CFU/ml; Cq24組菌落數(shù)由1740±121CFU/ml降至980±190 CFU/ml。當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度增加至4.5μM時(shí)其抑制作用更強(qiáng):Cq1組菌落數(shù)進(jìn)一步減少至360±45 CFU/ml; Cq40組菌落數(shù)減少至500±36 CFU/ml; Cq16組菌落數(shù)減少至430±30C

12、FU/ml; Cq24組菌落數(shù)減少至360±26 CFU/ml。與此相應(yīng)，銅綠假單胞菌感染所致的細(xì)胞LDH釋放（3μM穿心蓮內(nèi)酯的作用）:Cq1組由3128.3±456.939μ mol/ml下降至1875.8±16.061μ mol/ml; Cq40組由4082.45±133.307μ mol/ml下降至3175.266±298.927μmol/ml;Cq16組由3518.467±264.113μ mol/ml下降至2131.6±17

13、8.922μ mol/ml;Cq24組由2382.4±63.161μ mol/ml下降至1636.466±55.930μ mol/ml。穿心蓮內(nèi)酯濃度增加至4.5μM時(shí)，銅綠假單胞菌感染所致的細(xì)胞LDH釋放進(jìn)一步下降:Cq1組降至1061.366±165.731μ mol/ml; Cq40組降至1813±92.528μmol/ml; Cq16組降至1459.7±137.157μ mol/ml;Cq24組降至1016.133±77.309

14、μmol/ml。在穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)前后兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且兩種不同濃度穿心蓮內(nèi)酯之間的作用強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3μM穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)后，IL-6的生成:Cq1組由25.133±0.204 pg/ml降至17.557±0.318 pg/ml; Cq40組由12.495±0.691 pg/ml降至8.576±0.657 pg/ml; Cq16組由15.130±0.449 pg/ml降至10.780±0.98

15、2 pg/ml; Cq24組由24.106±1.107 pg/ml降至18.360±0.221pg/ml。IL-8的生成:Cq1組由593.866±48.981 pg/ml降至372.466±3.2653 pg/ml; Cq40組由472.5±48.350 pg/ml降至339.6±5.556pg/ml; Cq16組由488.833±39.480 pg/ml降至251.93±2.9004 pg/ml;Cq24組由569.833±26.3

16、85 pg/ml降至345.4±8.006 pg/ml。當(dāng)穿心蓮內(nèi)酯濃度增加至4.5μM時(shí)其抑制作用更強(qiáng)，IL-6的生成水平進(jìn)一步下降:Cq1組降至8.865±0.175 pg/ml;Cq40組降至3.761±0.209pg/ml; Cq16組降至3.348±0.341 pg/ml; Cq24組降至8.833±0.574pg/ml。IL-8的生成水平也顯著下降:Cq1組降至215.266±8.558pg/ml; Cq40組降至187.5

17、66±3.677 pg/ml; Cq16組降至89.76±4.677pg/ml; Cq24組降至300.466±13.9004 pg/ml。3μ M穿心蓮內(nèi)酯使用前后銅綠假單胞菌炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;4.5μM與3μ M的穿心蓮內(nèi)酯的作用強(qiáng)度之間的比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:臨床銅綠假單胞菌對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B具有侵襲力，使細(xì)胞LDH釋放量增加以及