熊果酸對PDGF誘導的活化型肝星狀細胞內(nèi)NOX信號通路的影響.pdf

1、背景:
　　肝纖維化是由多種病因所致的一種慢性肝損傷,在其發(fā)展過程中持續(xù)存在創(chuàng)傷愈合反應(yīng)。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)作為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的主要來源,它的激活、增殖和轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)病的關(guān)鍵。近年研究表明,HSCs內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導主要由NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen spec

2、ies, ROS)所調(diào)控,因此通過抑制HSCs內(nèi)NOX的活性,阻斷促纖維化因子在HSCs內(nèi)信號通路的傳遞,有望成為抑制肝纖維化的新方法。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸(ursolic acid,UA)可抑制瘦素誘導活化型HSCs的NOX的表達及其調(diào)控的信號通路活化。血小板衍生生長因子(Platelet-derived growth factors,PDGFs)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等多種促纖維化因子均參與HSCs的激活與增殖,熊果

3、酸是否能阻斷瘦素以外的促纖維化因子引起的HSC內(nèi)信號通路激活,尚待進一步研究。因此,本課題在前期研究基礎(chǔ)上,繼續(xù)探討熊果酸對PDGF誘導的HSCs內(nèi)NOX激活及纖維化信號通路的影響,力求闡明熊果酸抗纖維化的作用靶點和機制。
　　目的:
　　觀察熊果酸對PDGF誘導的大鼠活化型肝星狀細胞(HSC-T6)NOX激活及下游信號通路活化的影響。
　　方法:
　　取對數(shù)生長期HSC-T6細胞,隨機分成以下各組:空白對照組、

4、Rosup陽性對照組(5μg/ml)、熊果酸組(50μM)、PDGF-BB組(10ng/ml)、熊果酸干預(yù)組(熊果酸50μM+PDGF-BB10ng/ml)、DPI干預(yù)組(DPI20μM+PDGF-BB10ng/ml)、SB203580干預(yù)組(SB20358010μM+ PDGF-BB10ng/ml)、LY294002干預(yù)組(LY29400210μM+ PDGF-BB10ng/ml)。為觀察熊果酸對I型膠原表達的影響,藥物分別處理HSC

5、-T612h、24h后,采用熒光定量PCR檢測I型膠原mRNA的表達;為觀察熊果酸對NOX亞基p47phox蛋白膜移位的影響,藥物分別處理15min、30min、60min后,采用Western-blotting檢測膜蛋白p47phox的表達;為觀察熊果酸對HSCs內(nèi)ROS水平的影響,藥物分別處理10min、30min、1h、2h后,采用活性氧檢測試劑盒,利用活細胞工作站及熒光酶標儀檢測DCF熒光強度,觀察ROS水平;為觀察熊果酸對NO

6、X調(diào)控的信號通路PI3K-Akt、P38MAPK的影響,藥物分別處理15min、30min、60min后,采用Western-blotting檢測PI3K、P-AKT、P-P38MAPK蛋白的表達。
　　結(jié)果:
　　1.熊果酸對PDGF誘導HSC-T6內(nèi)I型膠原mRNA表達的影響
　　HSC-T6經(jīng)藥物刺激12h后,PDGF組I型膠原mRNA的表達比空白對照組明顯增加(P<0.01);熊果酸干預(yù)組I型膠原表達較PDGF

7、組明顯下降(P<0.01),較空白對照組無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05);熊果酸組I型膠原的表達低于空白對照組(P<0.05);DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組及LY294002干預(yù)組I型膠原的表達都明顯低于PDGF組(P<0.01);熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和LY294002干預(yù)組之間I型膠原表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可抑制PDGF-BB誘導的I型膠原mRNA的表達。

8、>　　2.熊果酸對PDGF誘導的HSC-T6細胞p47phox亞基向膜移位的影響
　　HSC-T6經(jīng)藥物作用15min后,PDGF組膜蛋白p47 phox表達比空白對照組顯著增加(P<0.05);熊果酸干預(yù)組p47phox的表達較PDGF組明顯降低(P<0.05),而與空白對照組無顯著統(tǒng)計學差異(P>0.05);熊果酸組p47phox的表達明顯低于空白對照組(P<0.01);DPI、SB203580及LY294002干預(yù)組p47p

9、hox的表達均低于PDGF組(P<0.05)。熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組和LY294002干預(yù)組之間膜蛋白p47phox的表達在統(tǒng)計學上無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導的NOX亞基p47phox
　　HSC-T6經(jīng)藥物作用1h后, PDGF組DCF熒光強度比空白對照組明顯升高(P<0.01),與Rorup陽性對照組無顯著差異(P>0.05);熊果酸干預(yù)組和DPI干預(yù)組的DCF

10、熒光強度均顯著低于PDGF組和Rosup陽性對照組(P<0.01),與空白對照組無顯著差異(P>0.05);熊果酸組的DCF熒光強度顯著低于空白對照組(P<0.01);熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組之間DCF熒光強度的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導的HSC-T6內(nèi)ROS的產(chǎn)生。3.熊果酸對PDGF介導的HSC-T6內(nèi)ROS生成的影響
　　4.熊果酸對PDGF誘導的HSC-T6內(nèi)PI3K-Akt、

11、P38MAPK信號通路的影響
　　4.1.熊果酸對PDGF介導的HSC-T6內(nèi)PI3K表達的影響
　　HSC-T6經(jīng)藥物作用30min后,PDGF組PI3K蛋白表達顯著高于空白對照組(P<0.01);熊果酸干預(yù)后PI3K蛋白的表達低于PDGF組和空白對照組(P<0.01, P<0.05);熊果酸組PI3K的表達低于空白對照組(P<0.01);DPI及LY294002干預(yù)后PI3K的表達均低于PDGF組( P<0.01);熊果

12、酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、LY294002干預(yù)組之間PI3K表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導的PI3K蛋白的表達。
　　4.2.熊果酸對PDGF介導的HSC-T6內(nèi)p-Akt表達的影響
　　HSC-T6經(jīng)藥物作用30min后,PDGF組p-Akt蛋白表達顯著高于空白對照組(P<0.01);熊果酸干預(yù)組p-Akt蛋白的表達較PDGF組顯著下降(P<0.01),較空白對照組差異無統(tǒng)計學意

13、義(P>0.05)。熊果酸組P-Akt的表達明顯低于空白對照組( P<0.01);DPI干預(yù)組及LY294002干預(yù)組P-Akt表達均低于PDGF組(P<0.05);熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、LY294002干預(yù)組之間p-Akt表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導的p-Akt蛋白的表達。
　　4.3.熊果酸對PDGF介導的HSC-T6內(nèi)P-P38MAPK表達的影響
　　HSC-T6經(jīng)

14、藥物作用30min后,PDGF組P-P38MAPK蛋白表達顯著高于空白對照組( P<0.01);熊果酸干預(yù)后P-P38MAPK蛋白的表達較PDGF組顯著下降(P<0.01),較空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。熊果酸組P-P38MAPK的表達明顯低于空白對照組(P<0.01);SB203580及DPI干預(yù)組P-P38MAPK表達均低于PDGF組(P<0.01);熊果酸干預(yù)組、DPI干預(yù)組、SB203580干預(yù)組之間P-P38M

15、APK表達的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。以上結(jié)果說明熊果酸可下調(diào)PDGF介導的P-P38MAPK蛋白的表達。
　　結(jié)論:
　　1、PDGF能誘導HSC-T6細胞的NOX亞基p47phox蛋白膜移位使NOX活化,并引起P38MAPK、PI3K-Akt信號通路的激活及I型膠原mRNA的表達增加。
　　2、熊果酸可抑制PDGF誘導HSC-T6細胞I型膠原mRNA的表達,其機制可能與通過抑制NOX亞基p47phox蛋白膜