熊果酸對大鼠肝星狀細(xì)胞NOX亞基p47phox及其調(diào)控的下游信號通路的影響.pdf

1、背景：肝纖維化是肝臟慢性損傷后的一種普遍現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝臟中過度沉積。瘦素是一個重要的促肝纖維化因子，它與HSC上的Ob受體結(jié)合后，引起Janus激酶(Janus kinase，JAK)磷酸化及JAK-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators oftranscription factor，STAT)的活化。JAK還通過激活還

2、原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，NOX)產(chǎn)生活性氧簇(Reactive oxygen spicies，ROS)，以還原-氧化方式激活細(xì)胞內(nèi)信號通路如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)及蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB，又稱AKT)，使信號級聯(lián)放大，導(dǎo)致與纖維生成及炎癥有關(guān)的基因表達(dá)。我們前期體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)熊果酸(Urs

3、olic acid，UA)能明顯改善肝纖維化大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)，效果優(yōu)于秋水仙堿，體外實驗發(fā)現(xiàn)UA能抑制HSC的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡；UA干預(yù)后能顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的NOX亞基p22Phox和Rac1 mRNA的表達(dá)及ROS的產(chǎn)生，并能抑制核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)激活，從而誘導(dǎo)HSC的凋亡。本研究將基于前期的研究結(jié)果，進(jìn)一步觀察UA對瘦素誘導(dǎo)的HSC NOX亞基p47Phox及下游信號通路ERK1/2的激

4、活和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響，探討UA抗肝纖維化的分子機制。
　　 目的：探索UA對大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)NOX亞基p47Phox及其調(diào)控的下游信號通路ERK1/2激活的影響，以及對HSC增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響，為UA應(yīng)用于抗肝纖維化治療提供理論依據(jù)。
　　 方法：將處于對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞分為6組：正常對照組；瘦素組(100ng/ml)；熊果酸(50μM)干預(yù)組(瘦素+熊果酸)；AG490(50μM)干預(yù)

5、組(瘦素+AG490)；DPI(20μM)干預(yù)組(瘦素+DPI)；PD98059(30μM)干預(yù)組(瘦素+PD98059)。在藥物作用HSC-T6細(xì)胞30min后，提取膜蛋白和總蛋白，采用Western blotting分別檢測p47Phox和p-ERK1/2的表達(dá)；藥物作用12h后，提取總RNA，采用RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原的表達(dá)；藥物作用12h、24h及48h后，采用MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果：⑴

6、熊果酸干預(yù)對瘦素誘導(dǎo)的NOX亞基p47phox蛋白膜移位的影響。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞30min后，細(xì)胞膜p47phox蛋白的表達(dá)較正常對照組升高(P<0.01)；熊果酸干預(yù)后的細(xì)胞膜p47phpx蛋白的表達(dá)明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AG490干預(yù)組及DPI干預(yù)組細(xì)胞膜p47phox蛋白的表達(dá)均低于瘦素組(P<0.01)；PD98059干預(yù)組細(xì)胞膜p47phox蛋白的表達(dá)低于瘦素

7、組(P<0.05)；熊果酸干預(yù)組、AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組間相比，細(xì)胞膜p47phox蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。上述結(jié)果表明熊果酸能抑制瘦素誘導(dǎo)的p47phox向細(xì)胞膜移位。⑵熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化的影響。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞30min后，細(xì)胞內(nèi)p-ERK1/2的表達(dá)較正常對照組升高(分別為P<0.01，P<0.05)；熊果酸干預(yù)后p-ERK1/2的表

8、達(dá)明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組p-ERK1/2的表達(dá)均低于瘦素組(分別為P<0.01，P<0.05)；熊果酸干預(yù)組、AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組間相比，p-ERK1/2表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。上述結(jié)果表明熊果酸可以降低瘦素介導(dǎo)的ERK1/2的磷酸化。⑶熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠

9、原mRNA表達(dá)的影響。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞12h后Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)較正常對照組升高(P<0.01)；熊果酸干預(yù)后Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)明顯低于瘦素組(P<0.01)，與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)均低于瘦素組(P<0.01)；熊果酸干預(yù)組、AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組間相比，Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意

10、義(均P>0.05)。上述結(jié)果表明熊果酸能下調(diào)瘦素介導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)。⑷熊果酸對瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖的影響。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞12h后細(xì)胞增殖高于正常對照組；熊果酸干預(yù)12h后細(xì)胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于DPI干預(yù)組的表達(dá)(P<0.01)，與AG490干預(yù)組、PD98059組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞24h后細(xì)胞增魑高于正常對照組；熊果酸干預(yù)24

11、h后細(xì)胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于AG490干預(yù)組、DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組(P<0.01)；AG490干預(yù)組細(xì)胞增殖低于DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組(P<0.01)；DPI干預(yù)組及PD98059干預(yù)組細(xì)胞增殖無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。瘦素刺激HSC-T6細(xì)胞48h后細(xì)胞增殖高于正常對照組；熊果酸干預(yù)組48h后細(xì)胞增殖低于瘦素組(P<0.01)，但高于DPI干預(yù)組(P<0.01)，與AG490干預(yù)組及PD

12、98059干預(yù)組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；DPI干預(yù)組48h后細(xì)胞增殖均低于熊果酸干預(yù)組、AG490干預(yù)組及PD98059干預(yù)組(P<0.01)；AG490干預(yù)組與PD98059干預(yù)組細(xì)胞增殖無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果表明瘦素可促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的增殖，而熊果酸可以抑制其增殖。
　　 結(jié)論：①瘦素能誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞的NOX亞基p47phox蛋白向細(xì)胞膜移位，使NOX激活，同時誘導(dǎo)了ERK1/2的磷酸化：熊果