熊果酸對(duì)NADPH氧化酶亞基在靜止型肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)及功能的影響.pdf

1、背景：
　　肝纖維化由各種慢性肝損傷引起的肝臟過度修復(fù)反應(yīng)造成，主要以I型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）在肝臟內(nèi)過度沉積為特征?；罨母涡菭罴?xì)胞（hepatic stellate cells,HSCs）是ECM的主要來源，所以靜止型HSC向活化型HSC激活、轉(zhuǎn)化的過程是肝纖維化的中心事件。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）及其產(chǎn)生的活性氧簇（reactiv

2、e oxygen species,ROS）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被證實(shí)在HSC的激活、轉(zhuǎn)化及肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展中具有十分重要的作用。
　　我們前期研發(fā)現(xiàn)中藥單體熊果酸能夠顯著抑制細(xì)胞因子瘦素、AngII及PDGF誘導(dǎo)的活化型HSCs內(nèi)NOX亞基的表達(dá)、NOX活性、NOX來源的ROS產(chǎn)生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制活化型HSCs的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮抗肝纖維化作用。那么熊果酸干預(yù)是否也能夠通過下

3、調(diào)NOX的表達(dá)而抑制靜止型HSC的活化，早期預(yù)防肝纖維化的發(fā)生，目前尚未闡明。本課題將繼續(xù)在前期研究的基礎(chǔ)上，以健康大鼠原代靜止型肝星狀細(xì)胞為研究對(duì)象，以TGF-β為促 HSC活化因子，探討熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達(dá)的影響及該影響與靜止型HSC激活、轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討熊果酸抗肝纖維化的作用機(jī)制。
　　目的：
　　探討熊果酸對(duì)大鼠靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達(dá)的影響，及該影響與靜止型HSC激活、

4、轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系。
　　方法：
　　采用肝臟原位灌注及密度梯度離心法從健康SD大鼠體內(nèi)分離提取原代靜止型HSCs，待原代HSCs自然培養(yǎng)至第5天時(shí)將細(xì)胞隨機(jī)分成五組并加用不同藥物進(jìn)行處理：空白對(duì)照組（control組，細(xì)胞自然培養(yǎng)活化），熊果酸組（UA組，40μM），TGF-β組（5μg/L），熊果酸干預(yù)組（UA+TGF-β組，UA40μM+TGF-β5μg/L），DPI干預(yù)組（DPI+TGF-Β組，DPI10μM+ TGF-

5、β5μg/L）。原代HSCs經(jīng)加藥處理24h后提取細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特異性標(biāo)志物α-SMA的蛋白表達(dá)水平。藥物作用12h后采用RT-qPCR檢測NOX亞基Rac1、p22phox及I型膠原的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中NOX亞基蛋白表達(dá)的影響
　　1.1 熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中g(shù)p91

6、phox蛋白表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后gp91phox蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸組NOX亞基gp91phox蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后gp91phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），并且與NOX抑制劑DPI干預(yù)組相比gp91phox蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靜

7、止型HSC活化過程中g(shù)p91phox蛋白表達(dá)明顯升高，而熊果酸干預(yù)能夠抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基gp91phox的蛋白表達(dá)。
　　1.2 熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中p67phox蛋白表達(dá)的影響
　　原代HSCs經(jīng)TGF-β刺激24h后NOX亞基p67phox蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸組p67phox蛋白表達(dá)則明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；用TGF-β刺激原代 HSCs之前加入熊果酸

8、進(jìn)行干預(yù)后p67phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組顯著降低（P<0.01），其與NOX抑制劑DPI干預(yù)組相比p67phox蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，靜止型HSC活化過程中p67phox蛋白表達(dá)明顯升高，而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p67phox的蛋白表達(dá)。
　　1.3 熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中p22phox蛋白表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs24h后

9、細(xì)胞內(nèi)p22phox的蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸組p22phox蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；TGF-β作用于原代HSCs前使用熊果酸干預(yù)使細(xì)胞內(nèi)p22phox蛋白水平較單純TGF-β刺激組均顯著降低（P<0.01），且與DPI干預(yù)組相比無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，靜止型HSC活化過程中p22phox蛋白表達(dá)水平明顯升高，而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p

10、22phox的蛋白表達(dá)。
　　2.熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中NOX亞基mRNA表達(dá)的影響
　　2.1 熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中Rac1mRNA表達(dá)的影響
　　用TGF-β刺激原代HSCs12h后細(xì)胞內(nèi)Rac1mRNA表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組（P<0.01）；熊果酸組原代HSCs內(nèi)Rac1 mRNA表達(dá)則顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）；在TGF-β刺激原代HSCs前分別給予熊果酸、DPI干預(yù)后Rac1 mRN

11、A表達(dá)較單純TGF-β組均明顯降低（均P<0.05），且該兩組間Rac1 mRNA表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯（P>0.05）。上述結(jié)果表明，靜止型HSC活化過程中Rac1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基Rac1的mRNA表達(dá)。
　　2.2 熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中p22phox mRNA表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激組原代HSCs內(nèi)p22phox mRNA表達(dá)明顯高于空白對(duì)

12、照組（P<0.01）；熊果酸組p22phox mRNA表達(dá)則明顯低于空白對(duì)照組（P<0.01）；在TGF-β刺激前給予熊果酸干預(yù)p22phox mRNA表達(dá)較單純TGF-β組明顯降低（P<0.01），且其效果與NOX抑制劑DPI干預(yù)組無明顯差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，靜止型HSC活化過程中p22phox mRNA表達(dá)水平明顯升高，而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型HSC活化過程中NOX亞基p22phox的mRNA表達(dá)。
　　3

13、.熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中α-SMA蛋白表達(dá)的影響
　　原代HSCs經(jīng)TGF-β刺激24h后α-SMA蛋白表達(dá)明高于空白對(duì)照組（P<0.05）；熊果酸作用于自然培養(yǎng)的原代HSCs后α-SMA蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；在TGF-β刺激前分別使用熊果酸、NOX抑制劑DPI進(jìn)行干預(yù)后α-SMA蛋白的表達(dá)較單純TGF-β刺激組均顯著下降（均P<0.01），較空白對(duì)照也均明顯下降（均P<0.05），且兩組間α-

14、SMA的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，NOX參與誘導(dǎo)HSC的活化，熊果酸干預(yù)能夠有效降低靜止型HSC活化過程中α-SMA的蛋白表達(dá)，抑制靜止型HSC的活化。
　　4.熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中I型膠原mRNA表達(dá)的影響
　　TGF-β刺激原代HSCs12h后I型膠原mRNA表達(dá)則明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05）；熊果酸組 I型膠原mRNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組（P<0.05）；在TGF-β刺激前分

15、別給予熊果酸、DPI干預(yù)后I型膠原mRNA表達(dá)較單純TGF-β刺激組均明顯降低（均 P<0.01），兩組間 I型膠原mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明，NOX參與調(diào)控HSC合成I型膠原，熊果酸干預(yù)能夠有效降低靜止型HSC活化過程中I型膠原的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1．在靜止型HSC活化過程中NOX亞基gp91phox、p67phox、p22phox、Rac1的蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高，熊果酸干預(yù)能