Ⅰ高膽固醇飲食誘發(fā)大鼠脂源性脂肪因子紊亂Ⅱ高膽固醇飲食誘發(fā)大鼠睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及功能障礙.pdf

1、脂肪是一個重要的內(nèi)分泌器官，可以通過分泌脂肪因子參與調(diào)節(jié)飲食，能量平衡及糖脂代謝等。脂肪因子被分成兩類:一類來源于脂肪組織及機(jī)體其他組織，如TNFα;另一類主要來源于脂肪組織，如瘦素，這些脂源性脂肪因子，不僅可以通過自分泌及旁分泌影響脂肪細(xì)胞的功能，還可以通過循環(huán)系統(tǒng)運送到其他器官及組織影響代謝反應(yīng)，在探討內(nèi)臟脂肪累積與2型糖尿病、心血管疾病、非酒精脂肪肝的發(fā)病機(jī)制方面起到了不可或缺作用。
　　脂肪組織作為體內(nèi)甘油三酯存儲的主要器

2、官，肥胖致脂肪因子合成及分泌紊亂已被廣泛研究。脂肪組織同樣是體內(nèi)最大的膽固醇池，膽固醇儲存量可達(dá)到總脂質(zhì)的0.5％。在肥胖狀態(tài)下，過多膽固醇在脂肪細(xì)胞累積導(dǎo)致細(xì)胞膨脹，胞膜流動性增高，引起脂肪細(xì)胞功能障礙。但目前關(guān)于高膽固醇飲食對脂肪合成及分泌脂肪因子功能的影響報道甚少，高膽固醇飲食的非肥胖依賴效應(yīng)也少有關(guān)注。本實驗采用與標(biāo)準(zhǔn)飼料等熱量添加的膽固醇飼料喂養(yǎng)構(gòu)建高膽固醇血癥大鼠模型，觀察高膽固醇飲食對大鼠內(nèi)臟脂肪組織及血清中脂源性脂肪因子

3、水平的動態(tài)影響。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　目的:
　　1、觀察不同時間高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗情況。
　　2、觀察高膽固醇飲食對血清及內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子（瘦素、抵抗素、內(nèi)脂素、脂聯(lián)素、磷脂?；嫉鞍拙厶?4）水平的影響。
　　3、觀察不同時間高膽固醇飲食喂養(yǎng)與各脂肪因子水平之間的時效關(guān)系。
　　方法:
　　1、動物模型:60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后根據(jù)體重隨機(jī)分為

4、普通飲食(NC)組及高膽固醇飲食(HC)組，分別給與標(biāo)準(zhǔn)飼料及高膽固醇添加飼料喂養(yǎng)。
　　2、標(biāo)本留取:喂養(yǎng)期間第0、4、12、18周由鎖骨下靜脈抽取空腹血，留取血樣;第0、4、18周處死大鼠后留取腎周白色脂肪組織，液氮保存。
　　3、血脂測定:大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平由奧林巴斯自動生化儀測定。
　　4、空腹血糖及空腹胰島素水平測定，計算胰島素抵抗指數(shù):分別采用葡萄糖氧化酶法及125I-胰島素

5、放免競爭分析法檢測空腹血糖、空腹胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(shù)。
　　5、酶聯(lián)免疫吸附方法分別檢測血清及內(nèi)臟脂肪組織中脂肪因子的水平。
　　結(jié)果:
　　1、高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平顯著增加。
　　2、僅在高膽固醇飲食持續(xù)喂養(yǎng)至第18周時大鼠HOMA-IR顯著增加，胰島素抵抗發(fā)生。
　　3、長期高膽固醇飲食（18周）增加大鼠內(nèi)臟脂肪組織瘦素水平。
　　4、高膽固醇飲食誘發(fā)

6、大鼠血清及內(nèi)臟脂肪組織抵抗素呈波動性變化。
　　5、高膽固醇飲食致大鼠內(nèi)臟脂肪組織內(nèi)脂素水平早期（4周）減少，后期(18周)升高。
　　6、隨著喂養(yǎng)時間的延長，高膽固醇飲食組大鼠血清及內(nèi)臟組織中脂聯(lián)素水平逐漸升高。
　　7、長期高膽固醇飲食（18周）升高大鼠內(nèi)臟脂肪組織中磷脂?；嫉鞍拙厶?4水平。
　　結(jié)論:
　　1、長期高膽固醇飲食喂養(yǎng)的大鼠出現(xiàn)了胰島素抵抗及脂肪功能紊亂:內(nèi)臟脂肪組織瘦素、磷脂?；嫉?/p>

7、白聚糖-4水平顯著升高;內(nèi)脂素水平早期減少，后期升高;血清及內(nèi)臟脂肪組織抵抗素水平呈現(xiàn)波動性變化;脂聯(lián)素水平逐漸升高。
　　2、在過量膽固醇攝入時，脂肪組織可分泌致胰島素抵抗的脂肪因子，以抵抗素變化最早，最為明顯。同時，脂肪組織還可分泌保護(hù)作用的脂肪因子，如脂聯(lián)素。這種變化可能與機(jī)體激活的代償反應(yīng)有關(guān)。上述結(jié)果充分說明了脂肪組織在高膽固醇飲食中發(fā)揮的重要調(diào)節(jié)作用。
　　目前男性生殖功能低下發(fā)病率逐漸升高并嚴(yán)重影響了人們的生活

8、質(zhì)量。男性生殖功能低下是由于睪丸生成睪酮及精子能力下降引起的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為低睪酮水平，伴有男性性欲減低、勃起功能障礙、生殖能力下降等臨床癥狀。睪丸作為男性最重要的生殖內(nèi)分泌器官，在維持男性性征、性行為、保證生殖功能發(fā)揮重要作用。睪丸主要功能為產(chǎn)生睪酮及精子。睪酮主要來源于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，不僅是維持男性表型的主要雄激素，還參與了骨質(zhì)疏松、代謝綜合征、心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。精子生成主要發(fā)生在睪丸曲細(xì)精管內(nèi)，由支持細(xì)胞提供營養(yǎng)。

9、　　膽固醇是人類飲食的主要組成部分，同時也是合成固醇類激素及維生素D的重要原料。但是，過量膽固醇攝入成為心血管疾病、非酒精性脂肪肝、癌癥及阿爾茨海默癥的獨立危險因素，成為增加疾病負(fù)擔(dān)及死亡率的主要原因之一。除了以上幾個方面，高膽固醇飲食對男性生殖功能的影響也引起了廣泛的臨床關(guān)注。我們前期的臨床流行病學(xué)調(diào)查在4114名中老年男性中發(fā)現(xiàn)血清總睪酮水平與總膽固醇水平呈負(fù)相關(guān)，與Tobias的研究結(jié)論一致。以往的動物實驗也在高膽固醇血癥大鼠及小

10、鼠中發(fā)現(xiàn)睪酮水平降低及精子數(shù)量、質(zhì)量下降。綜上研究，我們發(fā)現(xiàn)高膽固醇飲食損害男性生殖能力機(jī)制尚未明確，可能與睪丸合成睪酮及精子能力下降有關(guān)。
　　游離膽固醇可通過以下幾個方面介導(dǎo)毒性效應(yīng):1.細(xì)胞膜流動性喪失:細(xì)胞膜上正常的游離膽固醇/磷脂比例是維持細(xì)胞膜流動性的重要因素，如果該比值升高，細(xì)胞膜上脂質(zhì)結(jié)晶將引起細(xì)胞膜流動性的變化;2.破壞膜蛋白功能:游離膽固醇可通過抑制了細(xì)胞膜上一種或幾種蛋白質(zhì)功能介導(dǎo)細(xì)胞死亡。細(xì)胞器膜上的蛋白功

11、能也發(fā)生變化，例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Na+-Ca2+轉(zhuǎn)運蛋白。3.形成膽固醇結(jié)晶及氧甾酮:當(dāng)游離膽固醇/磷脂比值顯著升高時，膽固醇可形成針樣結(jié)晶破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性;過量細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇累積還可促進(jìn)膽固醇氧化，形成有毒的氧甾酮。細(xì)胞內(nèi)過量膽固醇負(fù)荷通過破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜流動性及膜蛋白功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白及錯誤折疊蛋白的累積，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。有研究報道高膽固醇飲食可激活小鼠下丘腦和動脈瓣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致意識障礙和動脈瓣鈣化。體內(nèi)試驗進(jìn)一步證實

12、膽固醇負(fù)荷的肝臟L02細(xì)胞中出現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。上述研究表明過量的膽固醇累積可能通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮其毒性作用。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了男性生殖功能損傷仍不明確。
　　目的:
　　1、觀察高膽固醇攝入對大鼠血清睪酮水平的影響。
　　2、進(jìn)一步觀察高膽固醇飲食對睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、生精細(xì)胞的影響。
　　3、深入探討高膽固醇攝入引起睪丸毒性的機(jī)制。
　　方法:
　　1、動物模型:60只SD大

13、鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后根據(jù)體重隨機(jī)分為普通飲食(NC)組及高膽固醇飲食(HC)組，分別給與標(biāo)準(zhǔn)飼料及高膽固醇添加飼料喂養(yǎng)。
　　2、標(biāo)本留取:喂養(yǎng)期間第4、8、12、16周由鎖骨下靜脈抽取空腹血，留取血樣;第16周處死大鼠后留取睪丸組織，多聚甲醛固定或液氮凍存。
　　3、血脂測定:大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯水平由奧林巴斯自動生化儀測定。
　　4、血清睪酮水平測定:采用125I-睪酮放免競爭分析法檢測血清

14、睪酮水平。
　　5、采用免疫熒光及免疫組化方法檢測間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、生精細(xì)胞標(biāo)志物3β-HSD、WT-1、DAZL在睪丸組織中的表達(dá);HE染色觀察睪丸組織整體結(jié)構(gòu)。
　　6、采用RT-PCR檢測睪酮合成相關(guān)分子StAR，P450scc，3β-HSD，P450c17，17β-HSD對應(yīng)的mRNA水平。
　　7、采用Western Blotting檢測睪酮合成相關(guān)分子StAR，P450scc，3β-HSD，P450c17

15、及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1、高膽固醇飲食喂養(yǎng)大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平顯著升高，長期高膽固醇攝入大鼠血清睪酮水平降低。
　　2、高膽固醇飲食持續(xù)喂養(yǎng)大鼠睪丸組織游離膽固醇沉積增加。
　　3、高膽固醇飲食大鼠間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、生精細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少。
　　4、高膽固醇飲食大鼠睪酮合成相關(guān)蛋白表達(dá)減少。
　　5、高膽固醇飲食大鼠睪丸組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活。