SD大鼠舌背味蕾細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、本文研究?jī)?nèi)容及目的，擬進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：利用BrdU標(biāo)記舌背上皮細(xì)胞，研究其在舌背粘膜及味蕾的動(dòng)態(tài)分布，揭示味蕾細(xì)胞遷移特點(diǎn)及味蕾外周上皮在味蕾細(xì)胞更新中的作用，為味蕾細(xì)胞分化研究奠定基礎(chǔ)。建立舌背上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)方法。在此基礎(chǔ)上，將舌背上皮細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)，期望舌背上皮細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞建立連接關(guān)系，模擬體內(nèi)神經(jīng)支配情況，觀察在此培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞生長(zhǎng)特性，并檢測(cè)舌背上皮細(xì)胞CK8的表達(dá)情況，探討舌背上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成味蕾細(xì)胞的可行

2、性 第一部分：BrdU標(biāo)記SD大鼠舌背上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 研究材料與方法：36只2周齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組(8只)和實(shí)驗(yàn)組(28只)；空白對(duì)照組內(nèi)注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)注射BrdU(3mg/kg)，分別于給藥后2h、1d、3d、5d、8d、11d、14d過(guò)量注射戍巴比妥處死3只實(shí)驗(yàn)組及1只空白對(duì)照組動(dòng)物；給藥后8h，處死7只實(shí)驗(yàn)組及1只空白對(duì)照組動(dòng)物。切取舌體前份1/3，浸

3、泡入10％的中性福爾馬林溶液，固定24小時(shí)以上，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，BrdU單抗免疫組織化學(xué)檢測(cè)。 研究結(jié)果 2.1舌背黏膜的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞舌背粘膜都能發(fā)現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，開(kāi)始時(shí)位于上皮的基底細(xì)胞層，隨時(shí)間推移，棘層、顆粒層、角化層上皮內(nèi)逐漸出現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。在給藥1周后，上皮內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少；兩周后，上皮基本上己檢測(cè)不到陽(yáng)性細(xì)胞，只在基底層內(nèi)偶有散在的陽(yáng)性細(xì)胞。 2.2味蕾內(nèi)BrdU陽(yáng)性

4、細(xì)胞隨時(shí)間推移，味蕾內(nèi)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多，并從味蕾外周向中間遷移。 2.3味蕾與外周上皮的關(guān)系在給藥8h后，味蕾外周上皮細(xì)胞(STBEC)的BrdU陽(yáng)性率較味蕾內(nèi)高，差異有顯著性(P＜0.05)。周邊的味蕾細(xì)胞呈BrdU陽(yáng)性者，其鄰近的STBEC有較高的陽(yáng)性率(75％)，提示周邊的味蕾細(xì)胞可能由STBEC增殖分化形成。 研究結(jié)論：味蕾由處于各種不同分化階段的味蕾細(xì)胞組成；味蕾細(xì)胞可能來(lái)源于味蕾外周的舌背粘膜基底層細(xì)

5、胞。 第二部分：舌背上皮細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)及CK8表達(dá)檢測(cè)。 研究材料與方法： 1.1舌背上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定斷頸處死出生后1天的SD大鼠，70％乙醇浸泡3-5min，切取舌體及下頜。D-Hank's沖洗血跡，2.5g/L洗必泰浸泡5-8分鐘，雙倍濃度的雙抗及兩性霉素沖洗3-4次。置入盛有平衡液的三角燒杯內(nèi)，于粘膜下注射膠原酶(1mg/ml)，直至舌體發(fā)生腫脹，粘膜變白。37℃恒溫水浴箱內(nèi)，膠原酶(0.2mg

6、/ml)消化1h。剝離舌背粘膜，刮除粘膜下層殘留的上皮細(xì)胞并收集。制備細(xì)胞懸液并以濃度為1x105/ml接種于培養(yǎng)瓶，移入37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換液1次。倒置顯微鏡下觀察各代細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和增殖情況。當(dāng)細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶底70％時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法及透射電鏡觀察法對(duì)上皮細(xì)胞鑒定。 1.2神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定斷頸處死新生1天的SD大鼠，無(wú)菌條件下取大腦皮質(zhì)，置入Kreb's解剖液，解剖顯微

7、鏡下剝除腦膜后剪成0.5mm3小塊，平衡液洗滌3次，收集組織塊，胰酶消化，制備細(xì)胞懸液并以濃度為2.5×105/ml接種于L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)底，移入37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔2天換液1次。采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 1.3舌背上皮細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)將制備好的神經(jīng)元細(xì)胞懸液5x105/ml與上皮細(xì)胞懸液2x105/ml混均(V∶V為1∶1)，接種于培養(yǎng)瓶接種于L

8、-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶底，置于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，每隔2天換液1次。 1.4舌背上皮細(xì)胞CK8表達(dá)檢測(cè)采用細(xì)胞免疫化學(xué)法對(duì)共培養(yǎng)的上皮細(xì)胞CK8表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。 研究結(jié)果： 2.1舌背上皮細(xì)胞的培養(yǎng)接種時(shí)，原代細(xì)胞形狀大小不等，呈多樣性，表現(xiàn)為多角狀扁平細(xì)胞、體積較大的球形細(xì)胞和體積較小的球形細(xì)胞。大多數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)24小時(shí)后貼壁；在培養(yǎng)3天后，細(xì)胞增殖形成許多

9、小而不規(guī)則的細(xì)胞克隆或集落，開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增殖階段，形成細(xì)胞團(tuán)塊。隨著時(shí)間推移，細(xì)胞團(tuán)塊周圍結(jié)構(gòu)疏松，間隙增大，細(xì)胞團(tuán)塊不斷增大，融合、連接成片，排列成鋪路石狀，可傳3-4代。 2.2神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞與上皮細(xì)胞共培養(yǎng)1天后，神經(jīng)元細(xì)胞大部分貼壁，胞體飽滿，多呈紡錘狀，胞質(zhì)透亮，胞體內(nèi)伸出小突起，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，部分神經(jīng)元細(xì)胞聚集成簇。培養(yǎng)5天后，神經(jīng)元細(xì)胞的胞體增大，呈圓形或橢圓形，胞體周圍的突起充分伸展并延長(zhǎng)，形成單級(jí)或

10、多極突起，軸突間相互交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)10天后，大部分神經(jīng)元細(xì)胞已裂解。 2.3舌背上皮細(xì)胞與神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)共培養(yǎng)早期，其生長(zhǎng)特性與單獨(dú)培養(yǎng)相類似。培養(yǎng)5天后，上皮細(xì)胞增殖形成細(xì)胞群落，神經(jīng)元細(xì)胞部分死亡。鏡下可見(jiàn)上皮細(xì)胞中心或周圍者存在神經(jīng)元細(xì)胞。 2.4舌背上皮細(xì)胞CK8表達(dá)情況CK8細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在本實(shí)驗(yàn)條件下，舌背上皮細(xì)胞呈CK8陰性表達(dá)。 研究結(jié)論： 3.1以DMEM/F12為