SD大鼠失舌神經(jīng)動(dòng)物模型建立及對舌味蕾影響的初步研究.pdf

1、味覺是人體的重要生理感覺之一，對咀嚼、吞咽、胃腸蠕動(dòng)以及分泌活動(dòng)起著重要作用。而味蕾是味覺的感受器官，尤其是舌味蕾在人體的味覺感受中起著最重要的作用。味覺同痛覺、溫度覺、觸覺等其他感覺一樣，受交感神經(jīng)的支配。味覺神經(jīng)主要包括兩部分：面神經(jīng)的鼓索于下頜下神經(jīng)節(jié)交換神經(jīng)元后加入舌神經(jīng)支配舌前2／3；舌咽神經(jīng)支配舌后1／3的味覺。味覺神經(jīng)尤其是舌神經(jīng)的損傷在口腔臨床中比較常見，多見于下頜阻生第三磨牙拔除術(shù)、種植牙手術(shù)、外傷和唾液腺手術(shù)等，發(fā)生

2、率約為0.06％～11.5％。在腫瘤切除術(shù)中，尤其是惡性腫瘤累及舌神經(jīng)行半舌切除術(shù)甚至全舌切除術(shù)的患者，幾乎完全喪失一側(cè)或雙側(cè)舌神經(jīng)。舌神經(jīng)損傷后，患者不僅舌前2／3區(qū)域感覺異常、過敏或者遲鈍甚至完全喪失，出現(xiàn)疼痛麻木等，而且味蕾萎縮退化，味覺受到不同程度的障礙，影響食物的攝取和營養(yǎng)補(bǔ)充，甚至造成心理障礙，降低生存質(zhì)量。 目前，為了恢復(fù)味覺功能，主要方法是將受損傷的舌神經(jīng)即刻行神經(jīng)吻合術(shù)，以促進(jìn)神經(jīng)束向遠(yuǎn)端同功能神經(jīng)束的生長。而

3、對于惡性腫瘤患者，味覺功能的恢復(fù)及重建依然存在著巨大的困難。本課題在建立SD大鼠失舌神經(jīng)動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，觀察失舌神經(jīng)對味蕾的影響，檢測Shh在味蕾細(xì)胞中的表達(dá)變化，從分子生物學(xué)水平探討味蕾失神經(jīng)過程中的變化，為研究味覺功能重建提供理論依據(jù)。 研究目的： 首先建立SD大鼠失舌神經(jīng)的動(dòng)物模型，觀察味蕾在失神經(jīng)過程中的變化，并在此基礎(chǔ)上探討該過程產(chǎn)生的可能機(jī)制。 材料與方法： 1 SD大鼠失舌神經(jīng)動(dòng)物模型的建立

4、108只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重80～100g，隨機(jī)分為三組，正常組、單側(cè)失神經(jīng)組(取右側(cè)舌神經(jīng))、雙側(cè)失舌神經(jīng)組(剪取雙側(cè)舌神經(jīng))。10％水合氯醛(3ml／kg)腹腔注射麻醉，取口內(nèi)切口，于下頜磨牙舌側(cè)切開口底粘膜，顯露一側(cè)舌神經(jīng)，剪除約0.5cm，縫合口底粘膜。術(shù)后觀察大鼠的舌前2／3的顏色、溫度、質(zhì)地及活動(dòng)情況，體重變化，生存狀況，并于術(shù)后6h、12h、1d、2d、3d、5d、10d、15d、20d、1m、2m、3m過量注射10％

5、水合氯醛處死，剪取舌前2／3組織，立即將標(biāo)本放入電鏡固定液中固定，利用掃描電鏡觀察舌體表面菌狀乳頭形態(tài)及數(shù)量的變化：部分標(biāo)本放入10％福爾馬林中固定，制備石蠟標(biāo)本，進(jìn)行包埋、連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本切片6張，HE染色，光鏡下觀察失神經(jīng)后菌狀乳頭、味蕾、味孔的形態(tài)以及數(shù)量變化情況。 2失舌神經(jīng)對舌味蕾Shh表達(dá)的影響動(dòng)物模型建立同第一部分實(shí)驗(yàn)，108只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重約80～100g，隨機(jī)分為三組，正常組、單側(cè)失神經(jīng)組(取右側(cè)舌

6、神經(jīng))、雙側(cè)失舌神經(jīng)組。于術(shù)后6h、12h、1d、2d、3d、5d、10d、15d、20d、1m、2m、3m過量注射10％水合氯醛處死，剪取舌前2／3組織，0.996的生理鹽水沖洗干凈，放入10％福爾馬林中固定，制備石蠟標(biāo)本，進(jìn)行包埋、連續(xù)切片，每個(gè)標(biāo)本切片6張，免疫組織化學(xué)染色檢測Shh的表達(dá)情況。原位雜交技術(shù)檢測Shh在失舌神經(jīng)過程中的動(dòng)態(tài)分布情況。 結(jié)果： 1 SD大鼠失舌神經(jīng)動(dòng)物模型的建立 1.1體重變化

7、雙側(cè)失神經(jīng)組術(shù)后早期即出現(xiàn)明顯的舌尖部咬傷痕跡，第3d時(shí)損傷最嚴(yán)重，5d左右開始恢復(fù)，10d左右基本愈合；單側(cè)失神經(jīng)組大鼠舌尖部咬痕較雙側(cè)組輕微，早期亦可見粘膜紅腫，以后逐漸消退。雙側(cè)組體重增長率較單側(cè)失神經(jīng)組及正常組均有顯著性差異(F(正常)=66.097，P<0.0001；F(單側(cè))：119.069，P<0.0001)；單側(cè)組體重增長率亦與正常組有明顯差異(F=42.529，P<0.0001)。 1.2病理學(xué)結(jié)果光鏡下觀察見

8、雙側(cè)失神經(jīng)組菌狀乳頭及味蕾逐漸萎縮，數(shù)量逐漸減少，味蕾頂端的味孔亦逐漸萎縮甚至消失不可見，同時(shí)可見絲狀乳頭樣菌狀乳頭。單側(cè)失神經(jīng)組右側(cè)菌狀乳頭及味蕾亦可見萎縮，數(shù)量較左側(cè)顯著減少。 1.3掃描電鏡結(jié)果掃描電鏡觀察可見雙側(cè)組術(shù)后早期菌狀乳頭無明顯變化，3d時(shí)數(shù)量明顯減少(22±4.36)(雙側(cè)組右側(cè))，后隨著粘膜損傷愈合又有輕微增多，但隨著時(shí)間的延長酵母菌狀乳頭逐漸萎縮，表面層片狀結(jié)構(gòu)增多，直徑變小，數(shù)量減少，20d時(shí)達(dá)最少(11

9、±2.00)(雙側(cè)組右側(cè))，同時(shí)可見味孔縮小，絲狀乳頭樣菌狀乳頭數(shù)量明顯增多。3m時(shí)雙側(cè)失神經(jīng)組仍可見少量菌狀乳頭的存在(26.67±3.79)(雙側(cè)組右側(cè))，有些與正常形態(tài)無明顯差異，多數(shù)形似絲狀乳頭樣。單側(cè)組右側(cè)菌狀乳頭較左側(cè)可見明顯的萎縮，3d時(shí)數(shù)量開始明顯減少(49.67±3.06)，20d左右達(dá)最少(323.33±4.04)，以后隨時(shí)問延長可見數(shù)量少量增多，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于左側(cè)。 2失舌神經(jīng)對舌味蕾Shh表達(dá)的影響免疫組織

10、化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后12h雙側(cè)組在味蕾基底細(xì)胞層中Shh的表達(dá)仍為陽性，1d后幾乎無表達(dá)，術(shù)后3m亦未見表達(dá)。單側(cè)組右側(cè)1d時(shí)仍可見Shh的微弱表達(dá)，隨后的時(shí)間未見表達(dá)，但3m時(shí)可見少量表達(dá)。原位雜交結(jié)果見術(shù)后6h雙側(cè)組Shh的表達(dá)顯著下降，12h幾乎不可見，術(shù)后3m仍未見表達(dá)。單側(cè)組右側(cè)6h時(shí)亦可見Shh的表達(dá)明顯下降，12h仍可見少量表達(dá)，1d后表達(dá)消失，3m時(shí)亦可見微弱表達(dá)，與免疫組化結(jié)果一致。單側(cè)組左側(cè)術(shù)后Shh的表達(dá)均與正常組無明

11、顯差異。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠成功地模擬了臨床舌神經(jīng)缺損導(dǎo)致的味覺喪失過程； 2.舌神經(jīng)缺損程度不同，對大鼠生活行為、體重、舌創(chuàng)傷、菌狀乳頭及味蕾的影響亦不相同； 3.菌狀乳頭及其味蕾在舌神經(jīng)缺損后有一定的自行再生能力。 4.失舌神經(jīng)支配后，味蕾Shh的表達(dá)逐漸降低； 5.一側(cè)失神經(jīng)不影響健側(cè)的表達(dá)； 6.在一定時(shí)間內(nèi)，單側(cè)失神經(jīng)組可觀察到味蕾Shh表達(dá)的恢復(fù)，而雙側(cè)失神