廣西巴馬小型豬活化素β-,A-、β-,B-亞基基因成熟肽序列的克隆及原核表達(dá).pdf

1、活化素(activin，ACT)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族成員之一，是由兩個β亞單位通過二硫鍵相連而形成的二聚體可溶性糖蛋白，主要功能是通過活化素(activin，ACT)/抑制素(inhibin，INH)系統(tǒng)，參與下丘腦一垂體一卵巢軸調(diào)控來調(diào)節(jié)哺乳動物生殖細(xì)胞的發(fā)育與成熟。另外，活化素對體內(nèi)不同組織細(xì)胞如肝臟、腎臟及肌肉等還有著廣泛的調(diào)節(jié)功能。 本研究參照GenBank發(fā)表的豬活化素β<,A>、β<,B>基因序列，對

2、每個基因分別設(shè)計兩對特異性引物，分段擴(kuò)增，然后拼接。以廣西巴馬小型豬發(fā)情母豬卵巢組織總RNA為模板，通過反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出相應(yīng)的cDNA片段。擴(kuò)增片段純化后，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)菌擴(kuò)增，并測序。結(jié)果表明：擴(kuò)增得到的activin β<,A>基因序列為1472bp，幾乎包含了整個編碼序列；而擴(kuò)增得到的activin β<,B>為791 bp，包含整個成熟肽及部分信號肽DNA序列。同源性比較發(fā)現(xiàn)，廣

3、西巴馬小型豬activin β<,A>、β<,B>與GenBank報道的豬activin β<,A>、β<,B>基因序列的同源性分別達(dá)到99.8％和99.6％，與奶牛、馬及人等物種activin β<,A>、β<,B>基因序列的同源性也達(dá)到了90％以上，說明克隆得到的activin β<,A>、β<,B>基因序列的正確性。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)activin β<,A>有5處發(fā)生了單個堿基的突變：即編碼序列的第391位、496位、640位、126

4、7位及3’端調(diào)控序列上的一個堿基；activin β<,B>有3個堿基發(fā)生了突變：即編碼序列的第599位、732位及848位。根據(jù)activin β<,A>、β<,B>基因成熟肽序列，分別設(shè)計兩對引物，并在上下游引物上分別設(shè)計BamHl和EcoRI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增activjn β<,A>、β<,B>基因的成熟肽序列。經(jīng)BamHl和EcoRl酶切分別將各個成熟肽序列定向連接到原核表達(dá)載體pRSETA質(zhì)粒上，構(gòu)建ACT-pRSETA融合表達(dá)

5、載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 CDE3)LysS。ACT-pRSETA重組質(zhì)粒經(jīng)鑒定有正確的閱讀框后，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ACT融合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blotting分析，證明已成功地表達(dá)了activin β<,A>、β<,B>基因成熟肽序列的融合蛋白(各個片段的大小約為20KD)，此融合蛋白以包涵體的形式表達(dá)，有較高的表達(dá)量。誘導(dǎo)條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)。37℃下培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)的濃度為1 mM，誘導(dǎo)5-8h有較好的效果。