綠色熒光蛋白基因（gfp）轉(zhuǎn)化柑橘及植株再生.pdf

1、柑橘是世界第一大水果。通過遺傳改良方法創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)、多抗及不同成熟期的品種類型，是我國柑橘育種研究的重點。然而柑橘屬植物存在珠心胚干擾、童期長、雄雌性敗育等現(xiàn)象，傳統(tǒng)育種手段效率不高、進(jìn)程緩慢。近年來，不斷完善的轉(zhuǎn)基因技術(shù)為我們提供了一種更加快速直接的育種和品種改良手段。 本實驗以柑橘愈傷組織和試管播種實生苗上胚軸為外植體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行綠色熒光蛋白基因(gfp)的轉(zhuǎn)化，獲得14個品種的轉(zhuǎn)基因材料，同時對轉(zhuǎn)化程序、轉(zhuǎn)化機(jī)制和

2、外源基因表達(dá)進(jìn)行了探討與分析。一些帶有GFP標(biāo)記的材料已用于本課題組的細(xì)胞融合和細(xì)胞凋亡等研究。眾多的轉(zhuǎn)基因柑橘細(xì)胞系還為后期的遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)機(jī)制研究提供了試材和便利。主要結(jié)果如下： 1)在得到的14個品種的轉(zhuǎn)基因材料中，2個品種獲得了再生植株，1個品種得到了試管苗，5個品種處于胚狀體階段，6個品種尚在愈傷組織階段。 2)共得到來自不同轉(zhuǎn)化事件的細(xì)胞系/株系93個，將進(jìn)行SouthernBlot分析，研究外源基因在柑橘中的

3、整合規(guī)律(整合位點、拷貝數(shù))。 3)溫州蜜柑品種國慶一號(G1)的轉(zhuǎn)GFP基因愈傷組織熒光表達(dá)強(qiáng)烈且穩(wěn)定，已成為本課題組細(xì)胞融合和細(xì)胞凋亡研究的一個活體工具材料。 4)比較了抗生素篩選與GFP熒光篩選的精確性及其對轉(zhuǎn)化進(jìn)程的影響，證實GFP篩選比抗生素篩選更快速、簡便、可靠，GFP標(biāo)記的應(yīng)用大大縮短了轉(zhuǎn)化所需的工作量和時間。 5)對決定柑橘愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的幾個因素進(jìn)行了比較與分析，表明：①轉(zhuǎn)化效率的前期決定因素

4、是農(nóng)桿菌與愈傷組織細(xì)胞的互作，以下操作可使這種互作有利于轉(zhuǎn)化效率達(dá)到較高水平：由繼代歷史不超過2年的農(nóng)桿菌菌株新長出的菌液侵染生長旺盛、顆粒狀明顯的淡黃色愈傷組織懸浮細(xì)胞，先搖動侵染體系使二者充分接觸，然后靜置20min使農(nóng)桿菌穩(wěn)定附著在植物細(xì)胞壁上；在侵染后共培養(yǎng)前使愈傷組織細(xì)胞造成損傷或在共培養(yǎng)基中加入創(chuàng)傷誘導(dǎo)因子(如AS)均有利于農(nóng)桿菌Vir基因的活化和T-DNA轉(zhuǎn)移。 ②轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活和再生是轉(zhuǎn)化成功的前提。采用繼代歷史

5、不超過3年的胚性愈傷組織以保證其較為健全的胚胎發(fā)生能力。為防止農(nóng)桿菌過度增殖對再生的毒害效應(yīng)，應(yīng)注意侵染濃度不宜過高、侵染時間和共培養(yǎng)時間不宜過長，在共培養(yǎng)后使用頭孢霉素防止農(nóng)桿菌殘留存活。共培養(yǎng)后最好能給愈傷組織1-2周的延遲篩選以使細(xì)胞恢復(fù)活力。在篩選培養(yǎng)時，要使每一塊愈傷組織能充分與培養(yǎng)基接觸以保證營養(yǎng)供給并接受抗生素的篩選；要及時將轉(zhuǎn)化愈傷組織團(tuán)挑出單獨在不加篩選抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并誘導(dǎo)再生，避免抗生素對再生的不良影響，縮短篩

6、選過程。 6)利用GFP熒光監(jiān)測了柑橘上胚軸切段的轉(zhuǎn)化與再生過程，發(fā)現(xiàn)： ①共培養(yǎng)后2-4周的暗培養(yǎng)使傷口表面形成愈傷組織，由這些愈傷組織可以分化出較多的小芽；若共培養(yǎng)后直接置于光下培養(yǎng)，切口發(fā)生硬化而難以出芽。 ②轉(zhuǎn)化芽點大多出現(xiàn)在傷口的形成層環(huán)部位。 ③逃逸體的存活有賴周圍轉(zhuǎn)化小芽的保護(hù)或因農(nóng)桿菌殘留而表現(xiàn)卡那霉素抗性，可見抗生素篩選的精確性不高。 7)對轉(zhuǎn)化子再生過程中的熒光表達(dá)進(jìn)行了連續(xù)觀

7、察，發(fā)現(xiàn)愈傷組織、黃化組織(根、莖尖)以及幼嫩小芽的熒光最為明亮；在轉(zhuǎn)化子變綠和繼代次數(shù)增多后，GFP熒光由于葉綠素自發(fā)紅色熒光的干擾而變得不明顯。 8)通過熒光檢測發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)基因嵌合體，分析由上胚軸得到的扇形嵌合體的成因，如果其轉(zhuǎn)化的部分來源于形成層環(huán)再生的愈傷組織細(xì)胞，另一部分來源于上胚軸的維管組織，這可能是“能夠感受農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞位于由傷口形成層環(huán)長出的愈傷組織中”的又一個試驗證據(jù)。 9)選取增殖快速的轉(zhuǎn)化材料