用綠色熒光蛋白和肝再生增強(qiáng)因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎的研究.pdf

1、內(nèi)蒙古大學(xué)博士學(xué)位論文用綠色熒光蛋白和肝再生增強(qiáng)因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎的研究姓名：馬玉珍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物學(xué)指導(dǎo)教師：扈廷茂20040501蘭至堡里堡壘莖壟墨里塑墅墨蘭壟墨里至差璺壟堡莖墨里堡苧墅墮塑! 墨共作用時(shí)間8 h r ，轉(zhuǎn)染效率為每視野4 2 個(gè)熒光細(xì)胞，F(xiàn) e g e n e 一6 轉(zhuǎn)染s F F C s 較為適宜的條件， F e g e n e 一6 6 u l ，D N A2 u g ，共作用時(shí)間1 2 h

2、 r 。轉(zhuǎn)染效率為每視野1 9 個(gè)熒光細(xì)胞。轉(zhuǎn)染結(jié)果表明：對(duì)于綿羊胎兒成纖維細(xì)胞，L i p o f e c t A M I N E “轉(zhuǎn)染效率較好，為目的基因轉(zhuǎn)染s F F C s 提供了參考依據(jù)。3 ．綠色熒光蛋白對(duì)綿羊胎兒成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及綿羊胎兒成纖維細(xì)胞性別鑒定L i p o f e c t A M I N E “介導(dǎo)p E G F P —C 1 轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的6 只綿羊胎兒s F F C s ，經(jīng)G 4 1 8篩選

3、1 2 天，挑選發(fā)綠色熒光的單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)2 3 天( 轉(zhuǎn)基因后共培養(yǎng)3 5天) ，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線以及染色體核型分析。結(jié)果表明，整合有E G F P基因的s F F C s 與對(duì)照組細(xì)胞比較，在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、染色體正確核型率上無(wú)明顯差別。同時(shí)利用P C R 方法對(duì)體外培養(yǎng)的6 只綿羊胎兒的s F F C s 進(jìn)行性別決定區(qū)( S e xd e t e r m i n i n gr e g i o no ft h e

4、Y ，S R Y ) 基因檢測(cè)，以明確s F F E s性別。結(jié)果顯示：6 只綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中，其中2 只為雌性胎兒細(xì)胞、4 只為雄性胎兒細(xì)胞，對(duì)S R Y 基因的分析與染色體分析結(jié)果一致，明確了s F F C s 的性別，可通過(guò)體細(xì)胞核移植進(jìn)j 亍己知性別的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊的研究。4 ．綠色熒光蛋白和肝再生增強(qiáng)因子融合基因在綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)利用L i p o f e c t A M I N E “介導(dǎo)線性化p E G F

5、P ／A L R 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染s F F C s 。經(jīng)G 4 1 8 篩選，l O d 后共形成3 8 個(gè)單克隆細(xì)胞，其中2 3 個(gè)克隆發(fā)熒光，1 j 個(gè)克隆不發(fā)熒光。挑選3 個(gè)熒光細(xì)胞克隆和3 個(gè)不發(fā)熒光的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，用P C R 、聚丙烯酰胺凝膠電泳及免疫組化檢測(cè)。結(jié)果表明：3 個(gè)熒光單克隆細(xì)胞均有A L R 、N e o ?；虻腜 C R 產(chǎn)物，聚丙烯酰胺凝膠電泳可見(jiàn)5 7 K D 大小的融合蛋白，免疫組化檢測(cè)到A L R 蛋