家蠶轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白-蜘蛛絲蛋白融合基因的研究.pdf

1、為了改善蠶絲的機(jī)械性，本研究以piggyBac轉(zhuǎn)座子載體為骨架，構(gòu)建了含有家蠶絲素重鏈蛋白的N-端區(qū)域(NTD)-綠色熒光蛋白(eGFP)-蜘蛛絲蛋白[A2S8]28-重鏈蛋白的C-端區(qū)域(CTD)融合基因表達(dá)元件的打靶載體pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD，同時(shí)根據(jù)絲素重鏈基因內(nèi)含子區(qū)域((AF226688:63011-63025和63052-63066)的DNA序列，設(shè)計(jì)組裝了TALENs序列，構(gòu)建了靶向絲素重鏈基因內(nèi)含

2、子區(qū)域的TALEN9-10載體；SURVEYOR和 lacZ中斷法證實(shí) TALEN9-10載體在家蠶卵母細(xì)胞株(BmN cells)中的效率約為13.95％。將TALEN9-10載體與打靶載體pXL-NTD-eGFP-Spider-CTD混合，通過真空電穿孔技術(shù)，導(dǎo)入家蠶初產(chǎn)卵，篩選獲得G0代轉(zhuǎn)基因家蠶。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，G0代轉(zhuǎn)基因家蠶蠶蛾基因組中有報(bào)告基因eGFP(e nha nce gree n fluo resce nce p

3、 rote in ge ne)的存在；Western Dot Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭蛋白樣品，證實(shí)轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)了家蠶絲素重鏈蛋白的N-端區(qū)域(NTD)-綠色熒光蛋白(eGFP)-蜘蛛絲蛋白[A2S8]28Spider-重鏈蛋白的C-端區(qū)域(NTD)融合基因；ELISA定量檢測(cè)顯示，eGFP在轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭蛋白可溶樣品中的含量約為4%(摩爾比)，推測(cè)表達(dá)的蜘蛛絲蛋白Spider[A2S8]28在可溶樣品中的摩爾比含量也為約4%。外源

4、DNA在家蠶基因組的定位分析顯示，外源DNA定位于家蠶基因組的23號(hào)染色體，打靶載體在轉(zhuǎn)基因家蠶基因組中的整合方式為隨機(jī)插入，并非由TALEN技術(shù)介導(dǎo)的定點(diǎn)插入；機(jī)械性能檢測(cè)結(jié)果顯示，G0代轉(zhuǎn)基因家蠶蠶絲的最大極限拉力(Ma x.Stre ss)提高了約40-50%，最高的最大極限拉力約為700MPa,平均值約為620MPa。挑取G0代繭絲最大極限拉力(Ma x.Stres s)最高的轉(zhuǎn)基因蠶雜交傳代，得到G1代轉(zhuǎn)蛛絲基因家蠶，檢測(cè)結(jié)果