綠色熒光蛋白(gfp)基因的克隆、表達(dá)和粗提取

1、1綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白(GFP)基因的克隆、表達(dá)和粗提取基因的克隆、表達(dá)和粗提取南方醫(yī)科大學(xué)2011預(yù)防醫(yī)學(xué)（衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫）摘要目的目的：研究綠色熒光蛋白（greenfluescentprotein，GFP）基因在大腸桿菌中的基因克隆與重組表達(dá)，以及對(duì)其進(jìn)行粗提取。方法方法：從E.coliDH5ɑ中用堿提取質(zhì)粒的方法提取質(zhì)粒pEGFPN3和質(zhì)粒pET28a。然后用質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)已經(jīng)提取的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，確定從大腸桿菌中成

2、功提取了質(zhì)粒。再用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和NotI對(duì)成功提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切后的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用以確定已經(jīng)提取了GFP基因。將含有GFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，用LB培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化后的E.coli進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。用IPTG誘導(dǎo)GFP基因表達(dá)可以看到淺綠色菌落。最后對(duì)綠色熒光蛋白進(jìn)行粗提取。結(jié)論結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生掌握最基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：綠色熒光蛋白基

3、因克隆重組表達(dá)轉(zhuǎn)化粗提取31前言前言綠色熒光蛋白（greenfluescentprotein，GFP）是一類(lèi)存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)，GFP發(fā)射綠色熒光。它產(chǎn)生熒光無(wú)需底物或輔因子發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級(jí)序列固有的。1962年，下村修等分離純化了水母中發(fā)光蛋白水母素，并發(fā)現(xiàn)一種綠色的熒光蛋白。1974年，他們分離得到了這個(gè)蛋白，當(dāng)時(shí)稱(chēng)綠色蛋白，以后稱(chēng)綠色熒光蛋白(GFP)[1]GFP作為

4、一種新的報(bào)告基因，其優(yōu)點(diǎn)在于①熒光強(qiáng)度高，穩(wěn)定性高；②GFP分子量小，易于融合，適用于多種轉(zhuǎn)化方式，對(duì)受體無(wú)毒害，安全可靠；③不需要反應(yīng)底物與其他輔助因子，受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生綠色熒光，尤其適用于體內(nèi)的即時(shí)檢測(cè)；④GFP不具有種屬依賴(lài)性，在多種原核和真核生物細(xì)胞中都表達(dá)；⑤通過(guò)替換一些特殊氨基酸，可以使之產(chǎn)生不同顏色的光，從而適應(yīng)不同的研究需要。近年來(lái)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移以及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化，以及細(xì)胞的分

5、離與純化等研究領(lǐng)域[2～3]。采用GFP作為標(biāo)記基因，可直接收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)，縮短了篩選時(shí)間、減少對(duì)細(xì)胞活性的影響并可作為活體標(biāo)記，為研究發(fā)育的基因調(diào)控和分子機(jī)制提供了一種簡(jiǎn)潔有效的手段[4、5]。采用基因工程手段生產(chǎn)GFP標(biāo)記的方法，可建立一種簡(jiǎn)便、快速的免疫診斷技術(shù)[6]。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌（Escherichiacoli）感受態(tài)細(xì)胞是分子克隆的關(guān)鍵步驟[7]，是基因克隆以及DNA文庫(kù)構(gòu)建等研究中一項(xiàng)重要的常規(guī)操作。目前，感受態(tài)

6、細(xì)胞的制備主要采用CaCl2法，該方法操作簡(jiǎn)單、容易掌握、重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應(yīng)用于一般的實(shí)驗(yàn)室。其原理是Ca2破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)陣列，并與膜上多聚羥基丁酸化合物、多聚無(wú)機(jī)磷酸形成復(fù)合物以利于外源DNA的滲入[8]。大腸桿菌是第一個(gè)用于重組蛋白生產(chǎn)的宿主菌，它不僅具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、生長(zhǎng)繁殖快、成本低廉、可以快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白等優(yōu)點(diǎn)[9]。而且其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)