熒光蛋白 (整理)

1、熒光熒光1、定義定義熒光（fluescence）又作“螢光”，是指一種光致發(fā)光的冷發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某種常溫物質(zhì)經(jīng)某種波長(zhǎng)的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長(zhǎng)長(zhǎng)的出射光（通常波長(zhǎng)在可見光波段）；而且一旦停止入射光，發(fā)光現(xiàn)象也隨之立即消失。具有這種性質(zhì)的出射光就被稱之為熒光。2、原理原理光照射到某些原子時(shí)，光的能量使原子核周圍的一些電子由原來(lái)的軌道躍遷到了能量更高的軌道，即從基態(tài)躍遷到

2、第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等。第一激發(fā)單線態(tài)或第二激發(fā)單線態(tài)等是不穩(wěn)定的，所以會(huì)恢復(fù)基態(tài)，當(dāng)電子由第一激發(fā)單線態(tài)恢復(fù)到基態(tài)時(shí)，能量會(huì)以光的形式釋放，所以產(chǎn)生熒光。熒光是物質(zhì)吸收光照或者其他電磁輻射后發(fā)出的光。大多數(shù)情況下，發(fā)光波長(zhǎng)比吸收波長(zhǎng)較長(zhǎng)，能量更低。但是，當(dāng)吸收強(qiáng)度較大時(shí)，可能發(fā)生雙光子吸收現(xiàn)象，導(dǎo)致輻射波長(zhǎng)短于吸收波長(zhǎng)的情況發(fā)射。當(dāng)輻射波長(zhǎng)與吸收波長(zhǎng)相等時(shí)，既是共振熒光。熒光強(qiáng)度：熒光強(qiáng)度與該種物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率、消光系數(shù)以

3、及含量等因素有關(guān)。熒光量子產(chǎn)率Q：量子產(chǎn)率表示物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光的本領(lǐng)，是熒光物質(zhì)發(fā)出光子數(shù)與吸收光子數(shù)的比值。熒光蛋白分子的亮度由其量子產(chǎn)率與消光系數(shù)的乘積決定，與成像檢測(cè)靈敏度密切相關(guān)。3、熒光蛋白熒光蛋白進(jìn)該蛋白在細(xì)胞內(nèi)的降解。雖然，目前這些不穩(wěn)定變體還沒有在小鼠中應(yīng)用，但這些變體有利于實(shí)時(shí)追蹤基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)的研究。（6）增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（）增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFPEYFP）另一種紅移變體是增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYF

4、P），該變體有四個(gè)氨基酸突變。在527nm時(shí)，EYFP的發(fā)射光從綠色變?yōu)辄S綠色。EYFP熒光的亮度水平與EGFP相當(dāng)。EYFP抗酸性差、對(duì)鹵化物敏感，使它的應(yīng)用受到限制。在EYFP基礎(chǔ)上改進(jìn)的突變體mCitrine[21]和mVenus[22]是目前應(yīng)用最多的黃色熒光蛋白。（7）增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（）增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（EBFPEBFP）在光譜的另一端是藍(lán)色藍(lán)綠色變體，包括增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（EBFP）變體。它有四個(gè)氨基酸突變，激發(fā)波長(zhǎng)

5、和發(fā)射波長(zhǎng)分別為380nm和440nm。由于這些突變改進(jìn)了蛋白折疊和發(fā)色團(tuán)形成的效率，所以也增強(qiáng)了所發(fā)出熒光的亮度（與藍(lán)色變體相比）和蛋白溶解性。但唯一的不足之處，就是EBFP產(chǎn)生的熒光信號(hào)大致與wtGFP相當(dāng)。藍(lán)色熒光蛋白發(fā)光較弱，抗光漂白和抗酸性較差，用于細(xì)胞成像時(shí)背景信號(hào)高。針對(duì)EBFP開發(fā)的3個(gè)更亮的突變體：Azurite(亮度是EBFP的1.6倍)、EBFP2(亮度是EBFP的2倍，mTagBFP(亮度是EBFP的3.7倍)。

6、最亮的藍(lán)色熒光蛋白。mTagBFP是由紅色熒光蛋白TagRFP突變而來(lái)。（8）增強(qiáng)型藍(lán)綠色（青色）熒光蛋白）增強(qiáng)型藍(lán)綠色（青色）熒光蛋白（ECFPECFP）增強(qiáng)型藍(lán)綠色熒光蛋白（ECFP）是發(fā)出藍(lán)色藍(lán)綠色熒光的另一種變體，產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比wtGFP強(qiáng)。ECFP有六個(gè)氨基酸突變（表3），發(fā)射光譜從綠色遷移到藍(lán)綠色，最大激波長(zhǎng)在433nm（主峰）和453nm（次峰），最大發(fā)射在475nm，于510nm處有一肩峰（圖11）。ECFP另一特點(diǎn)

7、是比其它藍(lán)色藍(lán)綠色變體光漂白效應(yīng)弱，而且比EBFP的亮度強(qiáng)。值得一提的是，wtGFP的主要綠色熒光變體，如EGFP等已經(jīng)在ES細(xì)胞、基因打靶和轉(zhuǎn)基因小鼠研究中得到充分應(yīng)用。2、藍(lán)色及藍(lán)綠色熒光蛋白藍(lán)色及藍(lán)綠色熒光蛋白雖然EBFP是AequeaGFP來(lái)源的最早的光譜變體之一，但其亮度低、光穩(wěn)定性差，使其很久以來(lái)沒有引起多數(shù)研究者的注意。最近，有三個(gè)研究小組報(bào)道指出，改進(jìn)的藍(lán)色Aequea熒光蛋白變體與EBFP相比，亮度和光敏感性有明顯增強(qiáng)

8、。這些新的變體被命名為Azurite（石青或藍(lán)銅礦）、強(qiáng)力增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白2（stronglyenhancedbluefluescentprotein2SBFP2）及EBFP2，它們第一次使得活細(xì)胞在藍(lán)色光譜區(qū)域成功地長(zhǎng)時(shí)間成像成為可能。即使這三種熒光蛋白在高濃度的微環(huán)境中表現(xiàn)出很弱的二聚體特性，但是它們能夠在與亞細(xì)胞定位的靶蛋白融合中有效地發(fā)揮作用，并且它們能夠很容易地通過濾光片設(shè)備與標(biāo)準(zhǔn)的BFP及46二脒基2苯基吲哚（46diai