HER2基因和mdr1基因高表達腫瘤細胞對力達霉素的藥物敏感性.pdf

1、HER2受體是人類表皮生長因子受體家族四個成員之一，該受體被磷酸化后主要引起MAPK和PI3K/Akt二個下游細胞信號通路的激活，在細胞的生長、分化和凋亡等生理活動中發(fā)揮重要作用。HER2在多種腫瘤中都有較高的表達，HER2高表達的腫瘤患者預示著對化療的抗性、較高的惡性程度、較高的復發(fā)率和較短的生存期。腫瘤患者對化療藥物的敏感性還和腫瘤細胞HER2是否高表達有關系。 腫瘤細胞多藥抗藥(multidrugresistance，MD

2、R)是腫瘤化療失敗的重要原因，而由mdr1基因編碼的P-gp(P-glycoprotein)蛋白介導的多藥抗藥則是經典的多藥抗藥機制。P-gp作為跨膜蛋白，對天然的疏水性抗腫瘤藥物有較強的外排作用，導致細胞內藥物濃度下降，降低了藥物對腫瘤生長的抑制作用。 力達霉素(Lidamycin，LDM)是本研究室從一株放線菌(Streptomycesglobisporussp.C-1027)代謝產物中獲得的對腫瘤細胞有強烈殺傷作用的大分子

3、肽類抗腫瘤抗生素。本研究分別構建了HER2和mdr1基因的真核表達質粒，通過轉染分別獲得了HER2和mdr1高表達的腫瘤細胞株，并用來探討力達霉素對HER2和mdr1高表達的腫瘤細胞的抗腫瘤活性。 一、LDM與HER2高表達乳腺癌細胞藥物敏感性的關系本研究構建了能在真核細胞表達HER2的真核表達質粒pcDNA3.1/HER2。把該質粒轉染到HER2低表達的乳腺癌MCF-7細胞，獲得了穩(wěn)定高表達HER2的MCF-7/HER2細胞，

4、同時獲得了用空白質粒pcDNA3.1轉染的作為對照的細胞株MCF-7/plasmid細胞。單克隆MCF-7/HER2細胞經RT-PCR和Westernblot分析表明，HER2的mRNA和蛋白p185HER2表達水平大約均是MCF-7/plasmid細胞的50倍。細胞免疫熒光分析證實了MCF-7/HER2細胞p185HER2蛋白高表達并且分布在細胞膜上。這些結果表明，HER2基因已穩(wěn)定轉染到MCF-7/HER2細胞并高表達，MCF-7細

5、胞和MCF-7/HER2細胞可以作為分子靶點HER2的細胞模型進行藥物敏感性的研究。 MTT結果表明，相對于HER2低表達的MCF-7細胞，LDM對HER2高表達的MCF-7/HER2細胞的生長抑制作用沒有顯著改變，IC50值分別為0.0174±0.0023nM和0.0183±0.0036nM；另外四種細胞毒藥物ADR、MMC、MTX和5-FU對MCF-7/HER2細胞的IC50值也沒有發(fā)生顯著性變化；MCF-7/HER2細胞對

6、Taxol和VCR的敏感性下降，IC50值分別由MCF-7細胞的0.079±0.031μM和0.040±0.021μM升高到MCF-7/HER2細胞的0.753±0.174μM和2.03±0.43μM，這表明HER2高表達細胞對Taxol和VCR的藥物敏感性降低。 LDM兩個劑量組0.05mg/kg和0.025mg/kg對HER2低表達和高表達的乳腺癌細胞MCF-7及SKBr-3兩種裸鼠移植性腫瘤的抑制率沒有顯著性差異；Taxo

7、l20mg/kg及10mg/kg兩個劑量組對MCF-7細胞裸鼠移植性腫瘤的抑制率高于對SKBr-3細胞移植性腫瘤的抑制率，且有顯著性差異。結果提示，裸鼠移植性乳腺癌癌細胞HER2蛋白表達高低對LDM的抑瘤效果沒有影響，而HER2蛋白表達增高則會降低Taxol的抑瘤效果。 0.001nM、0.01nM、0.1nM和1.0nM濃度的LDM作用于MCF-7/HER2或SKBr-3細胞48小時，均引起HER2蛋白、HER2蛋白磷酸化和A

8、kt蛋白磷酸化水平的升高，并呈劑量依賴性；RT-PCR結果表明HER2mRNA水平也隨LDM濃度的升高而升高。由于LDM對MCF-7和MCF-7/HER2細胞的生長抑制作用無差異，表明HER2/PI3K/Akt信號通路在LDM抑制細胞生長過程中未起到作用或未起到主要作用。0.1nMLDM作用MCF-7/HER2細胞6小時后，HER2的蛋白水平達到最高，12小時、24小時和48小時HER2的蛋白水平與6小時的蛋白水平一致。0.01nM、1

9、.0nM、10nM和100nMLDM的輔基蛋白作用MCF-7/HER2細胞48小時沒有引起HER2蛋白水平的改變，表明HER2相關蛋白的改變是由LDM的烯二炔發(fā)色團引起的。0.01μM、0.1μM和1.0μMTaxol作用于MCF-7/HER2細胞48小時，HER2蛋白、HER2蛋白磷酸化和Akt蛋白磷酸化水平均沒有變化，表明Taxol對HER2/PI3K/Akt信號通路無影響。 我們用HER2反義寡核苷酸降低細胞的HER2表達

10、水平后檢測癌細胞對LDM的敏感性是否改變。0.5μMHER2反義寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotide，AS-ODN)作用SKBr-3細胞48小時可以抑制HER2的蛋白表達，隨著AS-ODN的濃度升高HER2的蛋白表達水平逐漸降低，呈劑量依賴關系。與未轉染細胞的IC50值相比較，盡管細胞經瞬時轉染AS-ODN后HER2蛋白水平下降，LDM對經1.0μMAS-ODN瞬時轉染的MCF-7細胞和SKBr-3細胞的

11、IC50值均沒有顯著性改變。本結果證實了癌細胞對LDM的敏感性不受HER2蛋白表達高低的影響。與未轉染細胞的IC50值相比較，Taxol對經1.0μMAS-ODN瞬時轉染的MCF-7細胞IC50值沒發(fā)生顯著性改變；對經1.0μMAS-ODN瞬時轉染的SKBr-3細胞的IC50值發(fā)生了顯著性改變，由未轉染SKBr-3細胞的4.21μM降低到經瞬時轉染SKBr-3細胞的1.62μM。本結果證實了癌細胞對Taxol的敏感性隨HER2蛋白表達降

12、低而增高。 Herceptin是抗HER2的人源化單克隆抗體，我們對Herceptin是否改變癌細胞對LDM的敏感性進行了分析。1.0μg/mlHerceptin作用于SKBr-3細胞48小時可以抑制HER2蛋白的表達，Herceptin濃度升高抑制作用增強。30μg/mlHerceptin和Taxol聯合分別作用于MCF-7細胞和SKBr-3細胞72小時，Taxol的IC50值較之于Taxol單獨用藥降低了9.2倍和49.8倍

13、。30μg/mlHerceptin和LDM聯用分別作用于MCF-7細胞和SKBr-3細胞72小時，LDM的IC50值較之于LDM單獨用藥降低了2.0倍和18.1倍。結果表明，Herceptin和LDM聯合作用于MCF-7或SKBr-3細胞存在加合作用；Herceptin和Taxol聯合作用于MCF-7或SKBr-3細胞均存在協(xié)同作用。 二、HER2受體抑制劑的篩選及抗腫瘤活性EMD31是本研究所合成的蒽酮類衍生物，其抗腫瘤活性

14、未見報道。大黃素(eModin)能抑制HER2的蛋白表達，對HER2高表達的腫瘤細胞有較強的生長抑制作用。本部分研究以emodin為陽性對照化合物，研究EMD31對HER2高表達細胞的生長抑制作用。Westernblot結果表明30μMemodin和30μMEMD31均能明顯抑制HER2的表達及其蛋白磷酸化水平，但30μMEMD31的抑制作用低于30μMemodin。MTT結果顯示，40μMEMD31對MCF-7和MCF-7/HER2細

15、胞增殖的抑制率分別為20.4％和31.9％，40μMemodin的抑制率則分別為50.8％和56.4％。EMD31對細胞的抑制作用低于emodin，但對HER2高表達細胞的抑制作用強于HER2低表達細胞。對于MCF-7細胞，emodin與Taxol、或與LDM聯用，EMD31與Taxol、或與LDM聯用均無協(xié)同抗腫瘤作用；對于MCF-7/HER2細胞emodin與Taxol、或與LDM聯用，EMD31與Taxol、或與LDM聯用均存在協(xié)

16、同抗腫瘤作用。結果表明EMD31可以作為HER2受體抑制劑，但作用低于emodin；EMD31與化療藥物聯用對HER2高表達乳腺癌細胞有協(xié)同抗腫瘤作用。 Geldanamycin(GDM)是本研究所根據文獻合成的化合物。GDM和分子伴侶Hsp90結合導致HER2蛋白表達被抑制。Westernblot結果表明50nMGDM明顯抑制HER2的表達，GDM濃度升高抑制作用增強。GDM對MCF-7、MCF-7/HER2和SKBr-3細胞

17、的IC50值分別為1.007μM、0.482μM和0.113μM，其生長抑制作用隨HER2表達升高而增強。50nMGDM與LDM聯用，對MCF-7細胞和MCF-7/HER2細胞均有協(xié)同抗腫瘤作用；10nM或50nMGDM與Taxol聯用，對MCF-7細胞和MCF-7/HER2細胞均有協(xié)同抗腫瘤作用。 三、耐藥基因mdr1高表達腫瘤細胞對LDM的藥物敏感性本部分實驗通過RT-PCR從多藥抗藥乳腺癌細胞MCF-7/ADR中獲取全長

18、mdr1cDNA，構建了mdr1真核表達質粒pcDNA3.1/mdr1，通過轉染獲得了穩(wěn)定高表達mdr1的人肝癌HepG2/mdr1細胞，該細胞具有P-gp蛋白外排藥物的活性，可作為篩選抗mdr1藥物的細胞模型。MTT法結果顯示，相對于HepG2細胞，具有多藥抗藥性的HepG2/mdr1細胞對LDM的敏感性沒有變化，IC50值分別為0.015nM和0.020nM；而Taxol、ADR、CDDP和5-FU的IC50值分別提高了40.3倍、