HL-60細(xì)胞RYBP基因沉默對化療藥物敏感性的的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究白血病 HL-60細(xì)胞株 RYBP基因沉默后對化療藥物敏感性的影響，進(jìn)一步探討RYBP基因與白血病療效、預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：構(gòu)建針對RYBP基因的shRNA干擾質(zhì)粒及空載體對照組質(zhì)粒,建立RYBP基因穩(wěn)定沉默的白血病細(xì)胞株HL-60，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測確定RYBP基因在mRNA和蛋白水平的沉默效果。然后用DNA ladder及Annexin V標(biāo)記的方法檢測各組HL-60細(xì)胞凋

2、亡的情況；用CCK-8法檢測HL-60細(xì)胞的增殖情況及對化療藥物阿糖胞苷和柔紅霉素的敏感性。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建RYBP shRNA慢病毒載體，包裝慢病毒并感染HL-60細(xì)胞。通過嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定沉默RYBP基因的HL-60細(xì)胞株。通過觀察綠色熒光蛋白（GFP）來監(jiān)測感染效率，發(fā)現(xiàn)RYBP shRNA組和NC組的GFP表達(dá)率>99％。
　　2.RYBP shRNA對RYBP基因表達(dá)的影響：RYBP sh

3、RNA組RYBP mRNA水平相對于NC組為（0.12±0.04），明顯低于NC組；與NC組比較，RYBP shRNA組RYBP蛋白表達(dá)量為（0.15±0.044），明顯低于NC組（0.62±0.006）(P<0.05)。Q-PCR及Western blot結(jié)果均證實(shí)RYBP shRNA作用于HL-60細(xì)胞后能有效抑制RYBP基因表達(dá)。
　　3.沉默HL-60細(xì)胞RYBP基因表達(dá)對凋亡與增殖的影響（未加化療藥物）：用DNA Lad

4、der檢測發(fā)現(xiàn)NC組體外培養(yǎng)48h后有明顯的DNA Ladder，而RYBP shRNA組培養(yǎng)同樣長時(shí)間后未見明顯的DNA Ladder；用Annexin V-APC/FVS450標(biāo)記發(fā)現(xiàn)NC組和RYBP shRNA組HL-60細(xì)胞24h的早中期凋亡率分別為(3.65±0.04)％和(0.51±0.06)％、48h早中期凋亡率分別為（11.38±1.14）%和（2.46±0.06）%，RYBP shRNA組24h、48h的凋亡率均較NC

5、組明顯減少；而用CCK-8法發(fā)現(xiàn)RYBP shRNA組24h、48h的細(xì)胞活性相對于NC組分別為（1.47±0.02）、（1.22±0.04），RYBP shRNA組的細(xì)胞活性明顯高于NC組。
　　4.沉默HL-60細(xì)胞RYBP基因表達(dá)對阿糖胞苷敏感性的影響：流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn) NC+Arac組和RYBP shRNA+Arac組中24h早中期凋亡率分別為（20.93±2.11）%vs（5.62±0.43）%、48h早中期凋亡率分別為（

6、39.20±0.51）%vs（9.79±0.38）%，RYBP shRNA+Arac組24h、48h細(xì)胞早中期凋亡率比NC+Arac組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCK-8法發(fā)現(xiàn)NC+Arac組和RYBP shRNA+Arac組24h的抑制率為（22.5±1.00）%vs（3.6±0.01）%，48h抑制率為（40.6±1.20）%vs（18.3±1.88）%，RYBP shRNA+Arac組細(xì)胞24h、48h抑制率均比 NC+Arac組明

7、顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合流式與CCK-8法結(jié)果可知HL-60細(xì)胞RYBP基因沉默后對阿糖胞苷敏感性下降。
　　5.沉默HL-60細(xì)胞RYBP基因表達(dá)對柔紅霉素敏感性的影響：流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)NC+DNR組和RYBP shRNA+DNR組中24h早中期凋亡率分別為（33.90±0.66）%和（17.25+0.47）%、48h早中期凋亡率分別為（83.05±2.52）%和（59.04±3.80）%，RYBP shRNA+DNR組24

8、h、48h細(xì)胞早中期凋亡率均比 NC+DNR組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CCK-8法發(fā)現(xiàn) NC+DNR組和RYBP shRNA+DNR組24h的抑制率為（32.5±0.90）%vs（38.0±1.60）%，48h抑制率為（82.9±1.60）%vs（81.5±0.15）%，RYBP shRNA+DNR組的抑制率與NC+DNR組組抑制率差異不明顯。結(jié)合流式與CCK-8法結(jié)果可知HL-60細(xì)胞RYBP基因沉默后對柔紅霉素敏感性改變不明顯。