紡錘體檢查點(diǎn)蛋白BubR1和Cenp-E與肝癌細(xì)胞染色體數(shù)目異常的關(guān)系.pdf

1、目的： 研究紡錘體檢查點(diǎn)(spindle checkpoint,SCP)蛋白BubR1和Cenp-E在癌組織和正常肝組織表達(dá)差異，利用間接免疫熒光技術(shù)與RNAi技術(shù)在肝癌細(xì)胞系(HepG-2)和正常肝細(xì)胞系(LO2)中進(jìn)一步研究SCP基因BubRl和Cenp-E在肝癌細(xì)胞中的定位和作用。為進(jìn)一步闡明肝癌細(xì)胞染色體數(shù)目異常的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.用FQ-PCR和Western-blot，間接免疫熒光來(lái)檢測(cè)SC

2、P基因BubRl和Cenp-E在肝癌組織和正常肝組織基因和蛋白的表達(dá)情況。 2.用染色體分析技術(shù)分析人類肝癌細(xì)胞系(HepG-2)和人類正常肝細(xì)胞系(LO2)染色體數(shù)目異常情況。 3.用Nocodazole(諾考達(dá)唑)同時(shí)處理HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞使兩種細(xì)胞高度同步在分裂期，流式細(xì)胞儀測(cè)定處理前后的HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞同步在分裂期情況。 4.利用FQ-PCR和Western-blot檢測(cè)BubR1和

3、Cenp-E基因在兩種同步化的細(xì)胞mRNA和蛋白的表達(dá)水平。 5.間接免疫熒光技術(shù)觀察Cenp-E蛋白在兩種細(xì)胞中的定位及表達(dá)。 6.在LO2細(xì)胞中用RNAi技術(shù)干擾Cenp-E基因后，用FQ-PCR和Western-blot檢測(cè)BubR1和Cenp-E基因在干擾前后mRNA和蛋白的表達(dá)水平。并利用MTT，間接免疫熒光進(jìn)一步評(píng)價(jià)干擾后的細(xì)胞功能情況。 結(jié)果： 1.FQ-PCR和Western-blot，間接免疫熒

4、光檢測(cè)BubR1、Cenp-E基因在肝癌組織和正常肝組織表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BubR1和Cenp-E在正常肝組織的表達(dá)明顯高于肝癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.染色體分析發(fā)現(xiàn)HepG-2細(xì)胞染色體數(shù)目異常程度明顯高于LO2細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.用流式細(xì)胞儀檢測(cè)用Nocodazole處理前后的HepG-2細(xì)胞和LO2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)處理前兩種細(xì)胞G2-M期的比例差異不顯著。處理后兩種細(xì)胞的G2-M期細(xì)胞都大幅增加，但兩組細(xì)胞中期細(xì)

5、胞比例差異不顯著。 4.FQ-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，Nocodazole處理前BubR1和C-E基因和蛋白在LO2和HepG-2細(xì)胞中表達(dá)無(wú)顯著差異，處理后BubR1和Cenp-E基因和蛋白在兩種細(xì)胞表達(dá)都增高，但LO2細(xì)胞上調(diào)水平大于HepG-2細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.間接免疫熒光結(jié)果顯示Cenp-E蛋白主要定位細(xì)胞核內(nèi)，并且在出現(xiàn)異常分裂的細(xì)胞核內(nèi)Cenp-E蛋白的表達(dá)明顯低于正常分裂的細(xì)