著絲粒蛋白CENP-E和CENP-I與染色體分離關(guān)系研究.pdf

1、在胚胎發(fā)育的早期進(jìn)行著旺盛的細(xì)胞有絲分裂，染色體正常分離到兩個(gè)子細(xì)胞是保證有絲分裂正常進(jìn)行的重要基礎(chǔ)，而染色體的正常分離與著絲粒結(jié)構(gòu)和功能、紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)監(jiān)控機(jī)制等有關(guān)。著絲粒蛋白質(zhì)(Centromere proteins,CENPs)是著絲粒組裝和功能發(fā)揮的基本組成單位，由位于著絲粒上的一組蛋白質(zhì)(已發(fā)現(xiàn)的將近80余種[1])構(gòu)成，它們?cè)诩?xì)胞分裂間期或分裂期定位在著絲粒上，共同參與著絲粒的組裝并影響其功能的正確行使。其中CENP-E不僅

2、參與著絲粒的組裝，而且還是紡錘體關(guān)卡蛋白檢查點(diǎn)的重要組成部分，是聯(lián)系著絲粒與紡錘體微管間的紐帶，并提供染色體運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力.CENP-I是著絲粒組裝過程中較上游的一個(gè)蛋白質(zhì)，在著絲粒裝配和功能發(fā)揮過程中可能具有重要作用。Nishihashi等[6]研究發(fā)現(xiàn)在雞的DT40細(xì)胞敲除CENP-I基因后，細(xì)胞將長時(shí)間停滯于分裂的前中期，并出現(xiàn)染色體錯(cuò)排。為了揭示在人類細(xì)胞中，CENP-E、CENP-I是否參與調(diào)控染色體分離和細(xì)胞正常分裂，本課題利用

3、定量PCR、Western-blot和間接免疫熒光技術(shù)對(duì)染色體數(shù)目異常和核型正常的胚胎絨毛細(xì)胞中CENP-E、CENP-I的表達(dá)進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)與后者相比，染色體數(shù)目異常的胚胎絨毛細(xì)胞中CENP-E、CENP-I在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)均明顯降低；并用RNAi技術(shù)構(gòu)建CENP-E、CENP-I缺陷表達(dá)的人胚胎絨毛細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染空載體的胚胎絨毛細(xì)胞相比，CENP-E、CENP-I表達(dá)降低的胚胎絨毛細(xì)胞生長速度明顯

4、減慢，G2/M期細(xì)胞增加，分裂期細(xì)胞比例增大，染色體數(shù)目異常率顯著增加。說明CENP-E、CENP-I參與著絲粒對(duì)細(xì)胞染色體分離和細(xì)胞增殖的調(diào)控，二者表達(dá)的降低可能是導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的重要原因。對(duì)CENP-E、CENP-I的進(jìn)一步研究，將為研究染色體數(shù)目異常胚胎自然流產(chǎn)機(jī)制提供新的參考指標(biāo)。 第一部分著絲粒蛋白質(zhì)CENP-I的原核表達(dá)、純化及抗體制備。 目的： 1、構(gòu)建pET32a/CENP-I原核表達(dá)載體

5、。 2、純化重組蛋白rCENP-I。 3、將重組蛋白免疫兔制備抗CENP-I抗體。 方法： 1、用RT-PCR的方法從Hela細(xì)胞總RNA中獲得編碼CENP-I蛋白第1～293位氨基酸的CENP-I cDNA序列，采用基因體外重組法將其克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)內(nèi)，獲得重組質(zhì)粒pET32a/CENP-I。 2、將測序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPT

6、G誘導(dǎo)表達(dá)、Ni2+-NTA親和層析純化獲得高純度的重組蛋白質(zhì)。 3、用純化的蛋白質(zhì)免疫家兔制備抗體，瓊脂糖免疫雙擴(kuò)法、ELISA法和Western-blot得到高效價(jià)的免疫血清，并用飽和硫酸銨初步純化抗體。 結(jié)果： 1、經(jīng)測序鑒定，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a/CENP-I。 2、重組蛋白經(jīng)Ni2+-NTA親和層析柱純化后在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，灰度掃描后用Bandscan分析重

7、組蛋白純度達(dá)90％以上，成功的獲得了rCENP-I蛋白。 3、將rCENP-I蛋白免疫兔后獲得了高效價(jià)的免疫血清，瓊脂糖雙擴(kuò)顯示免疫血清效價(jià)達(dá)1:16以上；ELISA法測免疫血清效價(jià)達(dá)1：20000，Western-blot顯示抗體效價(jià)達(dá)1:400，能用于檢測臨床標(biāo)本中的CENP-I蛋白。 結(jié)論：成功的構(gòu)建了pET32a/CENP-I表達(dá)載體、純化了CENP-I重組蛋白，并制備了效價(jià)較高的抗CENP-I抗體。

8、 第二部分染色體數(shù)目異常的自然流產(chǎn)胚胎絨毛細(xì)胞中CENP-E和CENP-I基因表達(dá)的臨床研究 目的： 1、通過T-A克隆獲得FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)品。 2、流產(chǎn)胚胎絨毛組織原代細(xì)胞培養(yǎng)，并通過染色體核型分析結(jié)果劃分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。 3、了解染色體數(shù)目異常的自然流產(chǎn)胚胎絨毛細(xì)胞中是否存在CENP-E和CENP-I基因的蛋白和/(或)mRNA水平的異常，探索靶基因的表達(dá)在染色體數(shù)目異常的胚胎發(fā)生中可能具有

9、的作用。 方法： 1、設(shè)計(jì)、合成CENP-E、CENP-I和內(nèi)參GAPDH基因的FQ-PCR引物和探針序列，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T載體連接，構(gòu)建靶基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品； 2、采用組織塊貼壁法、消化法和組織塊研磨法原代培養(yǎng)流產(chǎn)絨毛組織，通過直接染色體制備法、傳統(tǒng)染色體制備法和原位染色體制備法對(duì)培養(yǎng)的胚胎絨毛細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析：將取自人工流產(chǎn)絨毛組織的染色體數(shù)目正常的胚胎絨

10、毛細(xì)胞定為對(duì)照組，將來自自然流產(chǎn)絨毛組織的具有染色體數(shù)目異常核型的胚胎絨毛細(xì)胞定為實(shí)驗(yàn)組。 3、用real-time RT-PCR檢測CENP-E和CENP-I基因的mRNA水平的表達(dá)； 4、用 Western-blot和間接免疫熒光技術(shù)檢測CENP-E和CENP-I蛋白水平的表達(dá)； 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建CENP-E、CENP-I和內(nèi)參GAPDH基因的FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)品； 2、成功培養(yǎng)胚

11、胎絨毛細(xì)胞，并通過染色體核型分析，從人工流產(chǎn)絨毛組織中篩選到33例染色體數(shù)目正常的胚胎絨毛細(xì)胞，從自然流產(chǎn)的絨毛組織中篩選到23例染色體數(shù)目異常的胚胎絨毛細(xì)胞。 3、real-time PCR、Western-blot和間接免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中CENP-E和CENP-I的基因水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)均明顯降低。 結(jié)論：染色體數(shù)目異常的胚胎絨毛細(xì)胞中CENP-E和CENP-I表達(dá)降低可能是引起胚胎

12、染色體數(shù)目異常和胚胎發(fā)育異常的重要原因之一，對(duì)進(jìn)一步探索臨床早期診斷指標(biāo)和檢測方法具有重要意義。 第三部分RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)源CENP-E或CENP-I基因在胚胎絨毛細(xì)胞中的表達(dá) 目的： 1、構(gòu)建針對(duì)CENP-E和CENP-I基因的短發(fā)夾狀RNA(shRNA)表達(dá)載體； 2、shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胚胎絨毛細(xì)胞后，觀察靶基因表達(dá)的抑制。 3、了解CENP-E和CENP-I基因的表

13、達(dá)抑制對(duì)胚胎絨毛細(xì)胞增殖和染色體分離的影響，以及對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)。 方法： 1、設(shè)計(jì)、合成CENP-E和CENP-I基因的shRNA序列，與載體pgenesil-1連接，構(gòu)建靶基因的shRNA重組表達(dá)質(zhì)粒； 2、shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用real-time PCR、Western-blot和間接免疫熒光檢測mRNA水平和蛋白水平的變化，篩選有效的干擾質(zhì)粒和最佳基因抑制時(shí)間。 3、MTT法制備細(xì)胞生長曲

14、線，檢測基因抑制后對(duì)細(xì)胞生長的影響。 4、FCM檢測細(xì)胞周期的變化。 5、細(xì)胞分裂指數(shù)測定和染色體核型分析檢測基因抑制對(duì)染色體分離的影響。 結(jié)果： 1、成功構(gòu)建針對(duì)靶基因的shRNA重組質(zhì)粒。 2、設(shè)計(jì)的干擾序列中pshRNA-CENP-E-3和pshRNA-CENP-I-3是有效的干擾質(zhì)粒，于轉(zhuǎn)染后72h胚胎絨毛細(xì)胞靶基因的內(nèi)源性表達(dá)受到明顯抑制，其蛋白水平和mRNA水平都顯著下降。

15、 3、MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有效干擾組細(xì)胞生長較對(duì)照組明顯減慢，細(xì)胞增殖受到抑制。 4、FCM檢測顯示干擾后G2/M期的細(xì)胞比例增加；細(xì)胞分裂指數(shù)測定結(jié)果示隨轉(zhuǎn)染時(shí)間增加實(shí)驗(yàn)組中分裂期細(xì)胞所占比例也增加；核型分析顯示實(shí)驗(yàn)組中染色體數(shù)目異常細(xì)胞比例顯著增加。 結(jié)論：設(shè)計(jì)、合成針對(duì)靶基因的shRNA重組質(zhì)粒在胚胎絨毛細(xì)胞中能有效抑制靶基因的表達(dá)，細(xì)胞生長減慢、分裂期細(xì)胞增多、染色體數(shù)目異常細(xì)胞比率增加，說明CENP-E和