慢速冷凍及復(fù)蘇后培養(yǎng)時間對人類卵母細胞紡錘體和染色體影響的研究.pdf

1、目的 (1)通過小鼠成熟卵母細胞慢速冷凍實驗，探討冷凍液中不同的蔗糖濃度對小鼠成熟卵母細胞冷凍效果的影響；探討不同體外培養(yǎng)時間對小鼠復(fù)蘇后的卵母細胞受精和胚胎發(fā)育情況的影響；初步試驗輔助激活方法補救復(fù)蘇后單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)受精失敗的卵母細胞的可行性。(2)通過人成熟卵母細胞的慢速冷凍實驗，比較冷凍液中不同的蔗糖濃度對人類卵母細胞慢速冷凍效果的價值；(3)采用免疫熒光染色方法，通過激光共聚焦顯微鏡觀察人類成熟卵母細

2、胞冷凍前后、復(fù)蘇后不同時間內(nèi)紡錘體和染色體形態(tài)學(xué)變化；探討冷凍和體外培養(yǎng)時間對人類卵母細胞第二次減數(shù)分裂時期紡錘體和染色體的影響，為人類成熟卵母細胞凍融方法的改進和后期發(fā)育結(jié)局的改善提供實驗依據(jù)。 方法 (1)30只清潔級成年健康昆明小白鼠，進行控制性超促排卵(COH)后獲取小鼠成熟卵母細胞，比較冷凍液中不同蔗糖濃度(0.2mol/l蔗糖vs0.3mol/l蔗糖)的冷凍效果；(2)復(fù)蘇后存活良好的卵母細胞培養(yǎng)不同的時間(

3、1h、2h、3h、4h、5h)行ICSI，觀察受精和胚胎發(fā)育情況；比較新鮮和解凍后ICSI受精失敗的卵母細胞采用Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活的效果。(3)人成熟卵母細胞 124枚隨機分為兩組行慢速程序化冷凍，冷凍液中分別采用 0.2mol/l 蔗糖和0.3mol/l蔗糖，了解兩組凍融后的存活情況；(4)兩組存活良好、外觀形態(tài)正常的64枚卵母細胞，隨機分為3組，分別體外培養(yǎng)不同的時間(1h、3h、5h)，后固定熒光染色，

4、同時用18枚新鮮的人成熟卵母細胞熒光染色作為對照組，在激光共聚焦顯微鏡下觀察紡錘體和染色體的形態(tài)。 結(jié)果 (1)0.2mol/l蔗糖組和0.3mol/l蔗糖組相比，小鼠成熟卵母細胞凍融后存活率分別為60.5％、80.7％，兩組相比有顯著差異性(P<0.05)；復(fù)蘇后小鼠卵母細胞體外培養(yǎng)不同的時間(1h、2h、3h、4h、5h)，結(jié)果顯示培養(yǎng)3h、4h組的卵母細胞正常受精率、囊胚形成率和培養(yǎng)1h、2h組結(jié)果相比有明顯差異(

5、p<0.05)；3h、4h 兩組之間正常受精率和囊胚形成率相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)；培養(yǎng)1h、2h兩組結(jié)果相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)；培養(yǎng)5h組中部分卵母細胞ICSI前已經(jīng)發(fā)生卵裂，其剩余卵母細胞正常受精率和囊胚形成率和其它組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)；幾組正常受精后的胚胎卵裂率無統(tǒng)計學(xué)差異(p>0.05)。采用 Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素輔助激活解凍后ICSI受精失敗的卵母細胞，凍融組卵母細胞激活率明

6、顯低于新鮮組(30.4％vs71.1％，p <0.05)，凍融組有一枚激活的卵母細胞發(fā)育至囊胚。(2)人成熟卵母細胞采用慢速程序冷凍方法，冷凍液中采用0.2mol/l蔗糖和0.3mol/l蔗糖，存活率分別為56.5％、80.6％，兩組相比有明顯差異性(P<0.01)。復(fù)蘇后存活良好的人卵母細胞體外培養(yǎng)不同的時間(a組：1h、b組：3h、c組：5h)固定熒光染色，三組凍融后的卵母細胞紡錘體正常比例明顯低于對照組新鮮卵母細胞(10.0％vs

7、 83.3％,P<0.05；45.5％vs 83.3％，P<0.05；40.9％vs83.3％，P<0.05)；a組紡錘體的缺失率明顯高于對照組(45.0％vs 5.6％，p<0.5)。在凍融后的卵母細胞中，a組分別和b組、c組相比，紡錘體正常比例明顯下降(10.0％vs 45.5％，p<0.05；10.0％vs 40.9％，P<0.05)；紡錘體缺失率明顯增高(45.5％vs 13.6％，p<0.05；45.5％vs 13.6％，P<

8、0.05)。b、c兩組紡錘體觀察結(jié)果相比無明顯差異。a組與b組、c組和對照組三組相比，正常染色體率明顯降低(30.0％vs 68.2％,p<0.05；30.0％vs 63.6％，P<0.05；30.0％vs 77.8％，P<0.05)。b組、c組、對照組三組染色體觀察結(jié)果相比，無明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論 (1)慢速冷凍小鼠成熟卵母細胞，CPA中0.3mol/l蔗糖較0.2mol/l蔗糖可以明顯提高凍融后卵母細胞存

9、活率；復(fù)蘇后的小鼠卵母細胞ICSI前培養(yǎng)3～4h可以提高正常受精、胚胎分裂能力。用Ca<'2+>載體離子霉素聯(lián)合嘌呤霉素的輔助激活方法，可能會使復(fù)蘇后受精失敗的卵母細胞獲得正常受精和繼續(xù)發(fā)育的希望，但由于凍融過程對卵母細胞的損傷，與ICSI受精失敗的新鮮卵母細胞相比，復(fù)蘇后受精失敗的卵母細胞被補救激活的能力明顯下降。(2)慢速冷凍人類成熟卵母細胞，適當(dāng)提高CPA中蔗糖濃度同樣可以明顯提高存活率；采用免疫熒光染色和激光共聚焦顯微技術(shù)(CL