不同冷凍方法對小鼠及人類未成熟卵母細(xì)胞體外成熟及紡錘體的影響.pdf

1、凍存人類未成熟卵母細(xì)胞是一項極具價值和吸引力的技術(shù)，有廣闊的應(yīng)用前景。但是其研究進展并不順利，目前成功幾率非常有限，至今還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的冷凍方法。阻礙此項技術(shù)發(fā)展的主要原因在于冷凍損傷和未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)(Invitromaturation，IVM)尚未成熟。檢測冷凍損傷的靈敏指標(biāo)主要是處于卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂中期(MetaphaseⅡ，MⅡ)的紡錘體，其對溫度降低特別敏感，凍存過程可能造成不可逆損傷導(dǎo)致非整倍體畸形，這也是冷

2、凍人成熟卵母細(xì)胞面臨的主要難題。為了減少冷凍對紡錘體的損傷，一些研究者認(rèn)為凍存處于第一次減數(shù)分裂期，染色體被保護在生發(fā)泡內(nèi)，微管結(jié)構(gòu)尚未形成的未成熟卵母細(xì)胞似乎是更好的選擇，但是目前玻璃化冷凍和慢速冷凍一快速復(fù)溫法對人未成熟卵母細(xì)胞紡錘體的影響，文獻(xiàn)報道結(jié)果尚不一致。而且以往研究凍融卵母細(xì)胞紡錘體的方法如相差顯像技術(shù)、免疫熒光顯像技術(shù)等，需要固定和染色，都是侵襲性的，無法進一步探討胚胎發(fā)育潛能。近年來，Polscope(液晶偏振光顯微鏡

3、)成像系統(tǒng)結(jié)合液晶可變減速器、電子成像及數(shù)碼成像技術(shù)，觀測紡錘體前不需要對標(biāo)本進行固定和染色，能評估紡錘體與活體卵母細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)系。此成像系統(tǒng)的安全性已經(jīng)得到了證實，并在人體外受精-胚胎移植(Invitrofertilization-embryotransfer，IVF-ET)周期中應(yīng)用，但是Polscope觀察冷凍方法對活體人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟及紡錘體影響的研究較少，國內(nèi)尚未見報道。本研究通過三種玻璃化冷凍，進行小鼠生發(fā)泡期(Ge

4、rminalyesicle，GV)卵母細(xì)胞冷凍、解凍、體外成熟及胚胎發(fā)育的系列研究；進一步Polscope成像系統(tǒng)觀察不同冷凍方法對小鼠活體GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體的影響。在動物實驗基礎(chǔ)上，對人類未成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存進行初步探討，旨在為臨床選擇理想的冷凍方案及“人類未成熟卵母細(xì)胞庫”的最終建立提供理論和臨床依據(jù)。 研究對象： 小鼠來自河南省實驗動物中心；選自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2004.10.30-2

5、005.12.30自愿要求實施體外受精-胚胎移植的不孕癥患者夫婦，所有用于研究的人未成熟卵母細(xì)胞均經(jīng)患者知情同意。 研究方法： 1．分組 1．1三種玻璃化冷凍分組 小鼠GV期卵丘復(fù)合物(Cumulus-oocytecomplex，COCs)和經(jīng)過透明質(zhì)酸酶去除顆粒細(xì)胞的裸卵(Denudedoocyte，DO)用冷凍環(huán)和麥管作載體分別經(jīng)三種玻璃化冷凍。 1．2紡錘體觀察分組 將收集到的小鼠G

6、V期和MⅡ期COCs，分別隨機分為三組：慢速冷凍，快速復(fù)溫組；超高速玻璃化組(冷凍環(huán)三步乙二醇法)；對照組(未冷凍組)。 1．3人未成熟卵母細(xì)胞分組 根據(jù)本中心卵巢反應(yīng)不良改行IVM標(biāo)準(zhǔn)：促性腺激素(Gonadotropin，Gn)≥9天時卵泡直徑仍為10mm，E2水平低于1000Pmol/L,將人未成熟卵母細(xì)胞分為Gn≥9天組和Gn～<8天組；MI，GV，COCs三種冷凍狀態(tài)。未冷凍的人未成熟卵母細(xì)胞做為對照組。采用冷

7、凍環(huán)三步乙二醇法冷凍。 2．方法 2．1三種玻璃化冷凍 2．2收集本中心ⅣF刺激周期不同來源的人未成熟卵母細(xì)胞 2．3紡錘體觀察 2．4臨床應(yīng)用 結(jié)果： 1．玻璃化冷凍對小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟的影響 1．1三種玻璃化冷凍小鼠GV期COCs的結(jié)局比較 1．2三種玻璃化冷凍小鼠GV期DO的結(jié)局比較 1．3三步E－醇法中小鼠GV期COCs與DO的比較

8、2．不同冷凍方法對小鼠M¨和GV卵母細(xì)胞體外成熟及紡錘體的影響 2．1凍融對小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟及紡錘體的影響 2．2凍融對小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體的影響 2．3超高速玻璃化小鼠GV期與M期卵母細(xì)胞的比較 2．4慢速冷凍一快速復(fù)溫法小鼠GV期與M期卵母細(xì)胞的比較慢凍GV組紡錘體的出現(xiàn)率及有紡錘體的優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于慢凍MII組(P<0.05)。 3．凍融不同Gn人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟及紡錘

9、體的比較 4．臨床結(jié)果 4．1凍融人未成熟卵母細(xì)胞的臨床結(jié)果 4．2本中心IVM臨床結(jié)果 結(jié)論： 1．冷凍環(huán)三步L－醇法玻璃化冷凍優(yōu)于慢速冷凍．快速復(fù)溫法，是冷凍小鼠GV期COCs的理想方法。其凍存人類未成熟卵母細(xì)胞有較高存活率，但卵裂率低，臨床結(jié)果不理想。 2．冷凍小鼠GV期卵母細(xì)胞優(yōu)于MII期卵母細(xì)胞。 3．體外培養(yǎng)成熟及凍融后有紡錘體出現(xiàn)的小鼠卵母細(xì)胞有較高發(fā)育潛能。