人未成熟卵母細(xì)胞體外顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)的成熟檢測及臨床觀察.pdf

1、目的：探討人卵母細(xì)胞體外顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)對卵子胞質(zhì)成熟的影響，及適當(dāng)延長培養(yǎng)時間對體外成熟卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟的影響。(1)以皮質(zhì)顆粒作為卵母細(xì)胞胞漿成熟的檢測指標(biāo)，評價未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的核質(zhì)成熟的同步性。(2)多囊卵巢綜合征患者采用無刺激周期未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)，體外受精一胚胎移植，觀察其受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及著床率。從而尋找最佳的培養(yǎng)條件，以提高體外成熟培養(yǎng)的核質(zhì)同步性，提高卵母細(xì)胞的受精率，卵裂率，優(yōu)胚率和著床率。

2、 研究方法：(1)人未成熟卵母細(xì)胞的來源：未成熟卵來源于2005年3月～6月就診于山東省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的多囊卵巢綜合征患者，在人工周期或自然周期后月經(jīng)周期第3天抽取外周血進(jìn)行基礎(chǔ)內(nèi)分泌檢測，并進(jìn)行陰道B超監(jiān)測。于月經(jīng)第10～12天再次陰道超聲檢查，如果雙側(cè)卵巢無直徑>8mm的卵泡，注射HCG 10000IU，并于36h后在陰道超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道卵泡穿刺術(shù)采卵。經(jīng)患者同意，將穿刺中所獲得的未成熟卵母細(xì)胞供給本研究。本研究獲得山東省

3、立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意實施 (2)顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)：來自2005年3月～6月在我中心因男方因素行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)治療，符合以下條件者：女方年齡在25～32歲，內(nèi)分泌及各項檢測指標(biāo)在正常范圍，取卵個數(shù)為10～20個。采用常規(guī)長方案進(jìn)行促排卵，即于治療前周期的排卵后第7天開始用GnRHa 0.05mg肌注直至HCG日。于治療周期第3天開始，每天肌注2251U的重組卵泡刺激素(rFSH，Serono)。當(dāng)優(yōu)勢卵泡

4、直徑達(dá)到20mm時，肌注1 0000RJhCG，36小時后行陰道穿刺術(shù)取卵。上述患者的卵母細(xì)胞進(jìn)行單精子注射前用801U/mL透明質(zhì)酸酶消化卵冠丘復(fù)合物得到的顆粒細(xì)胞用于本研究。用80IU/ml的透明質(zhì)酸酶消化約30分鐘，待顆粒細(xì)胞團(tuán)變成單個細(xì)胞后，用IVM培養(yǎng)液(M-199培養(yǎng)液，20％FSB,50lU/ml青霉素，50 μg/ml鏈霉素，0.29mM丙酮酸鈉，1 μg/ml雌激素，10ng/mlEGF，0.075IU/ml FSH，

5、0.15IU/ml HCG)清洗，1000rpm/分離心2次，去上清，IVM培養(yǎng)液懸浮，按1×10<'5>細(xì)胞/ml置于四孔皿中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，形成顆粒細(xì)胞單層后換液繼續(xù)培養(yǎng)，待用。 (3)未成熟卵體外培養(yǎng)及染色、觀察：顆粒細(xì)胞單層與人未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時，48小時，以M-199培養(yǎng)液體外培養(yǎng)為對照組。應(yīng)用FITC-LCA標(biāo)記卵母細(xì)胞胞漿皮質(zhì)顆粒，激光共聚焦顯微鏡觀察皮質(zhì)顆粒分布型，檢測卵母細(xì)

6、胞胞質(zhì)成熟度。 (4)同意行未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)治療的多囊卵巢患者行未成熟卵母細(xì)胞體外顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)24小時成熟后，行卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，注射后的卵母細(xì)胞置于已平衡的HTF培養(yǎng)液(HTF培養(yǎng)液，10％SSS)微滴培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，授精后16小時后倒置顯微鏡下觀察受精情況，選取2PN受精卵在已平衡的P-1培養(yǎng)液(P-1培養(yǎng)液，10％SSS)繼續(xù)微滴培養(yǎng)。繼續(xù)觀察胚胎發(fā)育情況，挑出優(yōu)質(zhì)胚胎(6-8細(xì)胞，卵

7、裂球大小均勻，胞質(zhì)碎片<10％)一般情況下，取卵后4d行胚胎移植術(shù)。臨床隨訪妊娠結(jié)局。 結(jié)果：(1)實驗組與對照組卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)48小時核成熟率均顯著高于體外培養(yǎng)24小時(37/71 vs 43/71，P<0.05；39/69 vs 43/69,P<0.05)；卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)48小時胞質(zhì)成熟率與體外成熟培養(yǎng)24小時均無明顯差異(10/37vsll/43,P>0.05；27/39vs31/43,P>0.05)。顆

8、粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)組，培養(yǎng)24小時，48小時，皮質(zhì)顆粒周邊分布型比例均顯著高于對照組(27/39 vs 10/37,P<0.01；31/43 vs 11/43,P<0.05)。 (2)共培養(yǎng)IVM周期6個，獲卵母細(xì)胞數(shù)121個，獲成熟卵70個(57.85％，70/121)；受精卵55個(78.57％,55/70)，優(yōu)胚32個(45.71％,32/70)，對照IVM周期75個，獲卵母細(xì)胞數(shù)1283個，獲成熟卵838個(65.3

9、％,838/1283)；受精卵553個(60.0％,553/838)；優(yōu)胚199個(23.7％，199/838)。實驗組與對照組比較，成熟卵母細(xì)胞率無顯著差異(P>0.05)；受精率及優(yōu)胚率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；P<0.05)。實驗組移植6個周期，臨床妊娠1例；對照組移植75個周期，妊娠18例。 結(jié)論：體外培養(yǎng)成熟的卵母細(xì)胞存在著核質(zhì)成熟的不同步性；顆粒細(xì)胞單層與未成熟卵母細(xì)胞體外共培養(yǎng)促進(jìn)卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成