冷凍不同成熟階段小鼠卵母細胞對其紡錘體及染色體分布的影響.pdf

1、研究背景：
　　在現(xiàn)代輔助生殖技術（ART）中常用的促排卵方案是通過應用大量的激素對卵巢進行刺激而獲得成熟卵子進而進行體外受精-胚胎移植技術（IVF-ET），然而，大劑量的使用激素同時帶來了弊端，如促性腺激素反復刺激，提高卵巢過刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生率，尤其是對于多囊卵巢綜合癥（PCOS）的患者來說，發(fā)生OHSS的幾率相對更高。同時，對卵巢的反復刺激可能會增加卵巢癌、子宮內膜癌和乳腺癌的發(fā)病率。如果可以跳過使用大量激素進行卵

2、巢刺激這一環(huán)節(jié)，直接利用不成熟卵子，那么將會使患者獲得更加安全和簡單的IVF治療。
　　卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）技術為輔助生殖技術治療不孕癥提供了新的選擇。IVM是指從卵巢上的小卵泡中獲取未成熟卵母細胞，在體外經(jīng)過適宜的條件進行成熟培養(yǎng)，使其發(fā)育成熟并獲得受精能力的過程。通常所說的 IVM技術是指卵母細胞體外成熟后再進行體外受精-胚胎移植技術。其臨床意義主要在于：避免超促排卵帶來的卵巢過度

3、刺激的風險，這對于PCOS患者尤其重要；減少刺激周期間促性腺激素對其靶器官或組織（如子宮內膜、卵巢和乳房等）產生的不良影響；節(jié)省醫(yī)藥花費和治療時間；幫助解決卵巢組織冷凍保存后卵母細胞的成熟問題，以及未成熟卵母細胞冷凍后的應用問題(Dal Canto，Mignini Renzini et al.2006)；用于為卵巢去勢患者保存生育力和建立
　　“卵母細胞庫”(Grynberg，El Hachem et al.2013)，未成熟卵母

4、細胞的獲取可以在月經(jīng)周期的任意階段進行(Fadini，Mignini Renzini et al.2013)，可以防止促排卵過程拖延時間影響患者本身疾病的治療，更適用于激素敏感性腫瘤患者(Combelles and Chateau2012)；為有關卵母細胞成熟機制的研究建立體外模式。
　　卵母細胞發(fā)育至成熟是一個動態(tài)的過程，卵細胞的成熟包括細胞核的成熟、細胞質的成熟。其各細胞元件的形態(tài)和功能都會發(fā)生改變。卵母細胞體外成熟遇到的難題

5、之一就是細胞核和細胞質不能同步成熟的問題，由于IVM得到的卵母細胞核質發(fā)育不同步，得到的已經(jīng)排出第一極體的卵母細胞在細胞質方面還沒有做好受精的充分準備。冷凍對處于發(fā)育不同階段的卵母細胞的影響也是有差異的。未成熟卵母細胞的染色體被包裹在核膜內，而且尚未形成紡錘體結構，這些都是相對于成熟卵母細胞來說，未成熟卵母細胞更能耐受冷凍保存的重要理論依據(jù)。但是復蘇后體外培養(yǎng)方案仍是需要解決的關鍵困難，研究提示未成熟卵母細胞冷凍后仍能排出第一極體（胞核

6、成熟），但是胞質成熟能力可能（如紡錘體的形成）受損，從而影響以后的受精和進一步發(fā)育能力(Li，F(xiàn)eng et al.2006)。
　　第一部分體外成熟培養(yǎng)及玻璃化冷凍對小鼠卵母細胞紡錘體及染色體分布的影響
　　研究目的：
　　本研究通過比較小鼠未成熟卵母細胞在不同成熟階段（GV/MI期或MII期）玻璃化冷凍后的紡錘體和染色體分布情況，推測最佳的冷凍卵母細胞階段，以及如何更好地利用未成熟卵母細胞。
　　材料與方法：

7、
　　將小鼠未成熟卵母細胞隨機分為三組：IVM組、冷凍未成熟卵母細胞組及冷凍成熟卵母細胞組，并以體內成熟卵母細胞為對照組，對未成熟卵母細胞行體外成熟培養(yǎng)，對成熟卵母細胞進行紡錘體和染色體免疫熒光染色，統(tǒng)計復蘇存活率、紡錘體及染色體正常形態(tài)率。
　　結果：
　　1.未成熟卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍的復蘇存活率與體外成熟卵母細胞（IVM-MII）（冷凍未成熟卵母細胞組 vs冷凍成熟卵母細胞組：77.4％ vs85.1%，P=0.

8、832）無統(tǒng)計學差異；
　　2.經(jīng)玻璃化冷凍復蘇的未成熟卵母細胞與新鮮未成熟卵母細胞相比，體外培養(yǎng)成熟率顯著下降（冷凍未成熟卵母細胞組vs冷凍成熟卵母細胞組：47.4%vs77.7%，P＜0.05）；
　　3.未成熟卵母細胞行冷凍復蘇后再體外培養(yǎng)成熟得到的 MII期卵母細胞正常紡錘體和染色體的比例明顯低于未成熟卵母細胞先培養(yǎng)成熟再冷凍復蘇存活的MII（冷凍成熟卵母細胞組vs冷凍未成熟卵母細胞組：20.6% vs9.7%，P＜

9、0.05），且兩者都顯著低于新鮮IVM-MII及體內成熟的MII期卵母細胞（IVM組vs對照組：55.1%vs76.3%）（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.玻璃化冷凍處理可降低未成熟卵母細胞的體外培養(yǎng)成熟率；
　　2.相較于體內成熟的卵母細胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)得到的MII期卵母細胞紡錘體和染色體的正常率明顯降低；
　　3.對未成熟卵母細胞先經(jīng)體外培養(yǎng)成為成熟卵母細胞再行玻璃化冷凍保存可提高其有效利用率。

10、>　　第二部分體外成熟培養(yǎng)對小鼠卵母細胞發(fā)育潛能的影響
　　研究目的：
　　觀察小鼠未成熟卵母細胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)（IVM）處理后其受精及胚胎發(fā)育情況，探討體外成熟培養(yǎng)對卵母細胞發(fā)育潛能的影響。
　　材料與方法：
　　取小鼠未成熟卵母細胞進行體外成熟培養(yǎng)，得到成熟卵母細胞后用同種屬雄鼠精子進行體外受精并培養(yǎng)至囊胚期，以體內成熟的卵母細胞為對照。觀察對比兩組的受精率、卵裂率、囊胚形成率等，并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

11、　　結果：
　　1.未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的成熟率為77.0%。
　　2.未成熟卵母細胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)得到的成熟卵母細胞（IVM-MII）受精率明顯低于對照組（IVM-MII組vs對照組：39.5%vs76.3%，P＜0.05）。
　　3.未成熟卵母細胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)得到的成熟卵母細胞（IVM-MII）卵裂率明顯低于對照組（IVM-MII組vs對照組：37.8%vs89.3%，P＜0.05）。
　　4.未成熟