β-連環(huán)蛋白在TNF-Α和Fas誘導(dǎo)急性肝損傷中的雙重作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 急性肝功能衰竭是一種常見的臨床危重癥，常導(dǎo)致多器官功能衰竭，在全世界范圍內(nèi)有極高的致死率。臨床上對于急性肝損傷的治療缺乏特異性治療手段，預(yù)后不理想。盡管原位肝移植是目前治療急性肝損傷的最有效手段，但是由于供肝來源短缺、手術(shù)風(fēng)險高、費(fèi)用昂貴，且術(shù)后需長期服用免疫抑制劑，也導(dǎo)致大部分患者無法接受肝移植治療。
　　 急性肝衰竭的發(fā)生機(jī)制主要包括毒性物質(zhì)直接損傷細(xì)胞器引發(fā)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致原發(fā)性肝損傷，以及肝毒

2、性物質(zhì)刺激免疫系統(tǒng)活化引起繼發(fā)性肝損傷。因此，通過減輕細(xì)胞凋亡可作為治療急性肝損傷的新途徑。脂多糖(LPS)和D-半乳糖胺(GalN)聯(lián)合使用廣泛用于誘發(fā)小鼠急性肝損傷模型。TNF-α是在GalN/LPS模型中導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的最重要因子。Fas誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡在免疫介導(dǎo)的肝臟疾病中起重要作用， Fas抗原在肝細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，因而肝細(xì)胞對Fas誘導(dǎo)的肝損傷十分敏感。給予小鼠注射抗Fas抗體(Jo2)會產(chǎn)生致死性肝損傷。
　　 β-連

3、環(huán)蛋白(β-Catenin)是經(jīng)典Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、分化以及凋亡。Wnt/β-Catenin信號通路的異常改變，尤其是β-Catenin的持續(xù)活化在多種腫瘤中都有發(fā)生，包括原發(fā)性肝癌。β-Catenin對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用十分復(fù)雜，在本研究室前期工作中發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin小鼠對GalN/LPS誘導(dǎo)的肝損傷敏感性降低，而對Jo2誘導(dǎo)的肝損傷反應(yīng)加重。β-Catenin在兩種肝毒性藥物

4、誘導(dǎo)肝損傷過程中發(fā)揮雙重作用的機(jī)制還不清楚。
　　 本課題研究將利用肝細(xì)胞特異性β-Catenin敲除小鼠以及過表達(dá)β-Catenin的Hepa1-6細(xì)胞系從體內(nèi)外兩方面對β-Catenin在急性肝損傷中的作用進(jìn)行再一步驗(yàn)證，并探討其發(fā)揮雙重作用的機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 1.繁育肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin小鼠，小鼠的基因表型通過PCR驗(yàn)證;
　　 2.分別通過腹腔注射GalN/LPS和J

5、o2，建立小鼠肝損傷模型，處理6hr后收集肝臟標(biāo)本;
　　 3.使用TUNEL法檢測肝細(xì)胞凋亡，Western blot檢測肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase3;
　　 4.應(yīng)用si-RNA技術(shù)沉默Hepa1-6細(xì)胞中β-Catenin表達(dá)，沉默效率通過qRT-PCR和western blot檢測。應(yīng)用CCK-8檢測沉默β-Catenin后細(xì)胞對TNF-α和Jo2的細(xì)胞毒性作用;
　　 5.應(yīng)用免疫組化方

6、法檢測肝組織p65核轉(zhuǎn)位，報告基因檢測Hepa1-6細(xì)胞中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性;
　　 6.應(yīng)用qRT-PCR方法檢測NF-κB下游靶基因SOD2和A20表達(dá);
　　 7.應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測β-Catenin和p65結(jié)合程度;
　　 8.含突變β-Catenin的腺病毒S37A用于感染Hepa1-6細(xì)胞，建立過表達(dá)β-Catenin的Hepa1-6細(xì)胞。過表達(dá)效率通過western blot，報告基因和qRT-

7、PCR檢測;
　　 9.細(xì)胞免疫熒光檢測過表達(dá)β-Catenin后p65核轉(zhuǎn)位情況;
　　 10.應(yīng)用MDA試劑盒檢測過表達(dá)β-Catenin后Hepa1-6對TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用;
　　 11.qRT-PCR和Western blot檢測肝組織中Fas的表達(dá)情況。
　　 12.應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.肝細(xì)胞特異

8、性敲除β-Catenin減輕GalN/LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。Hepa1-6細(xì)胞干擾β-Catenin表達(dá)后TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡減少，而過表達(dá)β-Catenin后肝細(xì)胞死亡增多。
　　 2.β-Catenin通過與NF-κB結(jié)合，影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。受GalN/LPS刺激后，肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細(xì)胞中p65入核增加，下游靶基因A20和SOD2表達(dá)增加。Hepa1-6細(xì)胞過表達(dá)β-Catenin后p

9、65入核減少。
　　 3.肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin通過NF-κB加重GalN/LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Hepa1-6細(xì)胞過表達(dá)β-Catenin后TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激減弱。
　　 4.β-Catenin與NF-κB結(jié)合影響Fas表達(dá)。肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細(xì)胞Fas表達(dá)增加，肝臟對Jo2刺激的敏感性增加，肝損傷加重，細(xì)胞凋亡增加。
　　 結(jié)論:
　　 本研究從動物和細(xì)胞水

10、平證明β-Catenin在TNF-α和Fas所致的急性肝損傷中起不同作用。β-Catenin能夠加重由TNF-α誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，這主要是通過β-Catenin同NF-κB結(jié)合，抑制了其轉(zhuǎn)錄活性所致。此外，β-Catenin還可加重TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。由于Fas的表達(dá)也受NF-κB調(diào)控，肝細(xì)胞特異性敲除β-Catenin小鼠Fas表達(dá)增高，因而加重了Jo2誘導(dǎo)的肝損傷。β-Catenin通過與NF-κB的相互作用調(diào)節(jié)TNF-α和F