miR-29a在TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖與凋亡中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）引起的血管內(nèi)皮損傷在很多心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，miR-29a高表達(dá)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs）且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡。到目前為止，miR-29a在TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC中的作用及其信號路徑尚無報(bào)道，本研究的目的在于探討miR-29a在TNF-

2、α誘導(dǎo)的HUVEC中的表達(dá)及其在增殖與凋亡中的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　?。?）采用MTT法檢測不同濃度TNF-α（0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）分別處理不同時間（24 h、36 h、48 h）對HUVECs增殖的影響；然后用不同濃度TNF-α（0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）

3、處理HUVECs不同時間（0 h、12 h、24 h、36 h、48 h），通過Heochst33342染色、Annexin V-FITC/ PI雙染法、Western blot法檢測HUVECs的凋亡程度，篩選出TNF-α誘導(dǎo)HUVECs增殖與凋亡的最佳濃度和時間；
　?。?）采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測miR-29a/b/c在TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs中的表達(dá)，篩選出表達(dá)變化的miRNA；
　?。?）采用MTT法檢測不

4、同濃度miR-29a mimics（0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L）分別轉(zhuǎn)染不同時間（24 h、36 h、48 h）對HUVECs增殖活力的影響，篩選最佳轉(zhuǎn)染濃度和時間；再用實(shí)時熒光定量PCR法檢測過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-29a對HUVECs中miR-29a表達(dá)的影響；MTT法檢測 miR-29a對 TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖的影響；Heochst33342和A

5、nnexin V-FITC/ PI雙染法檢測其凋亡；Western blot分析檢測其對凋亡相關(guān)蛋白 Bax、Bcl-2、caspase-3表達(dá)的影響；
　?。?）使用miRanda和Tangetscan軟件分析，結(jié)合目前文獻(xiàn)的報(bào)道，預(yù)測miR-29a的凋亡相關(guān)靶基因，采用Western blot法檢測其靶基因的表達(dá)變化；再采用MTT法和Annexin V-FITC/PI雙染法分別檢測其靶基因在 TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs增殖與

6、凋亡中的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　?。?）TNF-α呈劑量和時間依賴性抑制HUVECs增殖及促進(jìn)其凋亡，且篩選出最佳的誘導(dǎo)濃度為10 ng/ml、時間為24 h。
　?。?）TNF-α（10 ng/ml）處理HUVECs24 h后，相比于空白對照組，miR-29a的表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001），而miR-29b/c的表達(dá)無變化。
　?。?）MTT結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-29a能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVEC

7、s增殖（P＜0.001），而抑制表達(dá) miR-29a則呈現(xiàn)相反趨勢的結(jié)果；Heochst33342染色、Annexin V-FITC/ PI雙染法和Western blot法結(jié)果顯示：過表達(dá) miR-29a能顯著促進(jìn) TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（P＜0.001），而抑制表達(dá)miR-29a能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs凋亡（P＜0.001）。
　?。?）生物信息學(xué)分析及目前文獻(xiàn)的報(bào)道發(fā)現(xiàn)PI3K3R1(p85α)、AK

8、T3、Bcl-2是miR-29a的潛在靶基因；Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α（10ng/ml）誘導(dǎo)的HUVECs的p85α、Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)；miR-29a通過下調(diào) PI3K3R1(p85α)、Bcl-2的表達(dá)負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/Bcl-2通路；MTT和Annexin V-FITC/ PI雙染結(jié)果證明：阻斷PI3K/AKT/Bcl-2通路能減弱anti-miR-29a的促進(jìn)增殖及抑制細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
　　結(jié)論