miR-29a在球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生中的作用及其與冠心病之間的關(guān)系.pdf

1、目的:在血管損傷等刺激因素下血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)可由分化表型轉(zhuǎn)化為去分化表型并得以增殖能力。VSMC的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄等增殖性心血管疾病重要的病理學(xué)基礎(chǔ),所以抑制VSMC異常增殖是逆轉(zhuǎn)血管病變和防治心血管疾病的根本措施之一。冠心病(冠狀動(dòng)脈心臟病)是由于脂質(zhì)代謝不正常,血液中的脂質(zhì)沉著在原本光滑的動(dòng)脈內(nèi)膜上,逐漸形成動(dòng)脈粥樣斑塊,從而導(dǎo)致動(dòng)脈腔狹窄

2、,血流受阻而致病。
　　 microRNA(miRNA)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miRNA通過不完全互補(bǔ)結(jié)合到目標(biāo)靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上抑制蛋白質(zhì)的翻譯[1(,)2,3,4]。研究發(fā)現(xiàn),miRNAs存在于人類和其他動(dòng)物的血清和血漿中,其種類和數(shù)量可隨著生理狀況或疾病(癌癥、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等)而不同[5]。miR-29a是miR-29家族成員之一,最近研究顯示miR-29a廣泛

3、參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程[12]。本研究一方面觀察miR-29a在球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生中的作用及其分子機(jī)制。另一方面探討miR-29a在冠心病及其心血管并發(fā)癥中的作用,為冠心瘸的診斷及預(yù)后提供一個(gè)新的分子標(biāo)志物。
　　 方法:用球囊損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生后,用Westernblot方法檢測血管壁中表型標(biāo)志物的表達(dá)。球囊損傷過表達(dá)miR-29a后,用HE染色觀察血管內(nèi)膜增生的情況,用westernbolt方法檢測血管壁中相關(guān)表

4、型標(biāo)志物的表達(dá)。收集冠心病病人血液,用Real-time方法檢測血液中miR-29a的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜的增生
　　 形態(tài)學(xué)分析顯示:隨著損傷時(shí)間的增加,中膜內(nèi)的VSMC的排列紊亂,內(nèi)膜呈彌漫性增厚,管腔逐漸縮小,其中損傷14天增生最為明顯(P＜0.05)。說明球囊損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增生模型構(gòu)建成功。
　　 2.球囊損傷影響血管壁中表型標(biāo)志物的表達(dá)
　　 West

5、ernblot檢測球囊損傷后血管壁中CyclinE、CDK2、PCNA、UBC9及K5的表達(dá),發(fā)現(xiàn)這些血管壁增殖標(biāo)志物的表達(dá)隨著損傷天數(shù)逐漸增加,于14天達(dá)到高峰。上述結(jié)果表明,球囊損傷誘導(dǎo)血管內(nèi)膜增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化與血管內(nèi)膜增生程度變化一致。
　　 3.miR-29a在血管內(nèi)膜增生組織中表達(dá)增加
　　 Real-timePCR結(jié)果顯示:球囊損傷7天后血管組織中miR-29a的表達(dá)與假手術(shù)組相比明顯增多,提示miR-

6、29a與血管內(nèi)膜的增生有一定的相關(guān)性。
　　 4.miR-29a過表達(dá)促進(jìn)球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生
　　 Real-timePCR結(jié)果首先證實(shí)pAd-miR-29a和anti-miR-29a(miR-29ainhibitor)轉(zhuǎn)染可以分別使miR-29a在血管組織穩(wěn)定表達(dá)或抑制。HE染色結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-29a(pAd-miR-29a組)血管內(nèi)膜的增生程度(3.2±0.15)顯著高于pAd組(p＜0.05)。相反地

7、,敲低miR-29a表達(dá)(anti-miR-29a組)內(nèi)膜增生程度(0.15±0.03)較模型組(model14d組)(1.23±0.15)顯著下降(P＜0.05)。這些結(jié)果提示,miR-29a過表達(dá)促進(jìn)球囊損傷后血管內(nèi)膜的增生,敲低miR-29a表達(dá)顯著抑制球囊損傷誘導(dǎo)的內(nèi)膜增生。
　　 5.過表達(dá)miR-29a促進(jìn)球囊損傷誘導(dǎo)的增殖相關(guān)基因PCNA、CyclinD1的表達(dá)
　　 Westernblot結(jié)果顯示:過表達(dá)

8、miR-29a后可明顯上調(diào)球囊損傷誘導(dǎo)的增殖相關(guān)基因血管壁中PCNA和CyclinD1的表達(dá),而敲低miR-29a后表達(dá)水平明顯下降。RT-PCR結(jié)果與Westernblot結(jié)果相一致。這提示,過表達(dá)miR-29a促進(jìn)球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生可能與促進(jìn)增殖相關(guān)基因PCNA和CyclinD1的表達(dá)有關(guān)。
　　 6.過表達(dá)miR-29a促進(jìn)血管壁中K1f5的表達(dá)
　　 Westernblot結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-29a(

9、pAd-miR-29a組)后較pAd組K1f5的表達(dá)顯著增多;抑制miR-29a表達(dá)(anti-miR-29a組)K1f5表達(dá)較模型組(model14d組)組明顯減少。RT-PCR結(jié)果與Westernblot結(jié)果相一致,這表明miR-29a可能通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子K1f5的表達(dá)而促進(jìn)增殖相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 7.冠心病患者體內(nèi)miR-29a的表達(dá)
　　 Real-timePCR結(jié)果顯示:miR-29a的水平在冠心病患者血液

10、中(2.22±0.09mmol/L)與正常人(6.92±0.12mmol/L)相比明顯下降(P＜0.01)。
　　 8血清中miR-29a含量與冠心病危險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析
　　 經(jīng)多因素Logistic回歸分析,通過偏相關(guān)分析控制了年齡、吸煙等混雜因素后,發(fā)現(xiàn)血清中miR-29a與高血脂與總膽固醇等心血管危險(xiǎn)因素呈明顯正相關(guān),而與其他危險(xiǎn)因素?zé)o關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-29a過表達(dá)促進(jìn)球囊損傷