過表達ANT1基因?qū)︻i總動脈球囊損傷SD大鼠血管內(nèi)膜增生的影響及機制的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 自上世紀70年代以來，包括經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(Percutaneous coronaryintervention，PTCA)、經(jīng)冠狀動脈內(nèi)旋切術、冠狀動脈內(nèi)支架植入術等技術在內(nèi)的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention，PCI)已經(jīng)成為臨床上治療冠心病的主要手段，但術后再狹窄(Restenosis，RS)的高發(fā)生率嚴重影響了PCI手術效果。相關研究表明

2、，使用PTCA和裸支架(Bare metal stent，BMS)植入術治療冠心病，RS的發(fā)生率在20-30%以上[1]。雖然近年來藥物洗脫支架(Drug eluting stent，DES)的應用以及術后藥物支持治療方法的進步使RS的發(fā)生率明顯下降，但依然保持在5-10%左右，伴有糖尿病的患者則更高[2]。目前對于再狹窄發(fā)生發(fā)展機制的認識仍不明確。通常認為，PCI術后再狹窄主要是由于手術過程中血管內(nèi)皮剝脫和血管內(nèi)膜下出血激發(fā)的一系列炎

3、癥反應所導致。在血管損傷基礎上，經(jīng)過臨床、生物學以及遺傳學相關RS危險因素的影響，炎癥反應激活，血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和凋亡失衡，大量細胞外基質(zhì)合成，最終導致內(nèi)膜過度增生[3，4]。因此，研究促進VSMC凋亡和抑制損傷后血管VSMC過度增殖對防治再狹窄具有重要的意義。
　　 腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT

4、)是一類位于線粒體內(nèi)膜的跨膜蛋白，參與構成線粒體膜通道性轉(zhuǎn)運孔(Mitochondrial permeability transitionpore，mPTP)。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開放，使線粒體功能失衡，線粒體膜電位(△ψm)降低，導致細胞凋亡。ANT的跨膜結構域分為基質(zhì)構象(m-構象)和胞質(zhì)構象(c-構象)兩部分，兩種構象可通過與ADP、ATP等底物結合而相互轉(zhuǎn)換，而使mPTP開放或關閉。Shen[5]等在細胞凋亡模式生物秀麗線蟲

5、模型上研究發(fā)現(xiàn)WAN-1是調(diào)控細胞凋亡的關鍵基因，而WAN-1與哺乳動物的ANT-1同源。有研究表明過表達ANT1可以誘導心肌細胞和腫瘤細胞凋亡，甚至縮小腫瘤體積[6，7]。其作用機制可能與ANT1作為mPTP重要組成部分有關，引起線粒體膜電位降低，從而觸發(fā)線粒體通路的細胞凋亡[8]。
　　 本實驗室前期研究已證實在體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞過表達ANT1可以誘導其凋亡，其機制可能通過上調(diào)Bax表達，使Bax/Bcl-2比例繼發(fā)升

6、高有關[9]。因此，本課題利用分子克隆技術構建的攜帶有ANT1基因的重組腺病毒感染頸總動脈球囊損傷再狹窄SD大鼠模型，通過RT-PCR、Western-Blotting、免疫組化和TUNEL法原位末端標記技術檢測過表達ANT1基因?qū)υ侏M窄大鼠模型球囊損傷后頸總動脈VSMCs的影響和內(nèi)膜的增生情況，探討ANT1能否作為PCI術后再狹窄防治的新靶點。
　　 實驗方法：
　　 1、實驗采用的包含有ANT1基因的重組腺病毒由本實

7、驗室李燕碩士提供，滴度為2×1011PFU/ml，可以用動物載體轉(zhuǎn)染。
　　 2、以健康雄性7周齡SD大鼠72只，體重280-300g，構建頸總動脈球囊損傷SD大鼠模型。分為假手術組、單純球囊損傷組、Ad-ANT1腺病毒轉(zhuǎn)染組和Ad-GFP空病毒轉(zhuǎn)染組，每組18只。除假手術組外，其余三組在球囊損傷剝脫血管內(nèi)皮后，分別向頸總動脈注入PBS緩沖液、Ad-GFP空載體腺病毒液和Ad-ANT1腺病毒液約40μl，作用30 min后，吸出

8、病毒液，生理鹽水沖洗管腔。
　　 3、分別在轉(zhuǎn)染后7d、14d、28d麻醉處死各組SD大鼠模型，取損傷側(cè)頸總動脈，剪取約0.5cm用于制作石蠟切片，HE染色評價血管內(nèi)膜增生情況；TUNEL法檢測頸總動脈細胞凋亡率；免疫組化檢測Bax和Bcl-2表達情況。
　　 4、損傷側(cè)頸總動脈除制作切片外的余下部分用于提取總RNA和總蛋白。利用RT-PCR和Western Blotting方法檢測各實驗組頸總動脈Bax和Bcl-2的m

9、RNA和蛋白表達水平。
　　 實驗結果：
　　 1、成功構建頸總動脈球囊損傷血管再狹窄大鼠模型，可以用于后續(xù)實驗。
　　 2、成功利用Ad-ANT1重組腺病毒載體將ANT1基因轉(zhuǎn)染頸總動脈球囊損傷SD大鼠模型，RT-PCR顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動脈單純損傷組比較，ANT1mRNA及蛋白的表達水平明顯增高。
　　 3、頸總動脈血管內(nèi)膜增生情況：Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組內(nèi)膜/中膜面積比

10、(IA/MA)與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動脈單純損傷組相比明顯減小。
　　 4、頸總動脈細胞凋亡情況：TUNEL檢測結果顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動脈單純損傷組比較，平滑肌細胞凋亡率顯著提高。
　　 5、免疫組化、RT-PCR和Western Blotting結果顯示Ad-ANT1轉(zhuǎn)染組與Ad-GFP轉(zhuǎn)染組和頸總動脈單純損傷組比較，Bax mRNA和蛋白表達水平明顯提高，而Bcl-2mRNA和蛋白