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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)是目前治療冠心病的安全、有效方法之一,但其遠(yuǎn)期效果受到局部血管再狹窄(restenosis,RS)的影響。
平滑肌22 alpha(smooth muscle22 alpha,SM22α)是血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)的一種分化標(biāo)志物,
2、其表達(dá)具有平滑肌組織特異性和細(xì)胞表型特異性。為了探討SM22α與血管內(nèi)膜增生的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)利用本室構(gòu)建的SM22α腺病毒載體表達(dá)系統(tǒng),將其導(dǎo)入內(nèi)膜剝脫的頸總動(dòng)脈壁,觀察其在血管壁中的表達(dá),以及對(duì)球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生的影響,揭示SM22α抑制內(nèi)膜增生的分子機(jī)制。
方法:
1頸總動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型的復(fù)制及分組
將SD大鼠(250~300 g)常規(guī)麻醉消毒,沿頸部正中線切口,分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)
3、脈與頸外動(dòng)脈,在頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一楔形切口,球囊導(dǎo)管自切口插入至主動(dòng)脈分支處,充盈球囊后將其拖回至頸外動(dòng)脈切口處,如此反復(fù)三次,球囊減壓后退出。夾閉頸總動(dòng)脈近心端,由切口處注入20μlpAd-SM22α溶液,結(jié)扎頸外動(dòng)脈,關(guān)閉切口。20 min后打開近心端血管夾,恢復(fù)血流。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組,uninfected組、pAd組和pAd-SM22α組。
2標(biāo)本的處理
術(shù)后從股動(dòng)脈放血處死大鼠。取大鼠
4、頸總動(dòng)脈并將血管分為兩部分,一部分勻漿,提取組織蛋白,用Western blot方法檢測(cè)血管壁中SM22α、p-Raf-1、p-MEK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)變化。另一部分做病理切片,HE染色觀察血管內(nèi)膜增生情況并進(jìn)行形態(tài)測(cè)量學(xué)分析,其余切片行免疫組織化學(xué)染色,觀察SM22α、PCNA和p27在血管壁中的表達(dá)情況。
結(jié)果:
1外源性SM22α在血管壁中的表達(dá)
Western blot結(jié)果顯
5、示,pAd-SM22α組中SM22α的表達(dá)水平明顯高于uninfected組和pAd組。同時(shí),免疫組織化學(xué)染色亦顯示,在pAd-SM22α轉(zhuǎn)染組血管壁中,SM22α的表達(dá)量明顯增加,陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量及著色強(qiáng)度較其余兩組明顯增強(qiáng),與Western blot結(jié)果一致。
2過(guò)表達(dá)SM22α抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生
形態(tài)學(xué)分析顯示,球囊損傷14天后,uninfected組與pAd組中膜內(nèi)的VSMC排列紊亂,內(nèi)膜
6、呈彌散性增厚,管腔縮小,內(nèi)膜/中膜(intima/media,I/M)比值分別為2.43±0.21和2.19±0.19,兩組之間無(wú)明顯差異。而pAd-SM22α組血管內(nèi)膜的增生程度和I/M比值(0.68±0.12)明顯小于uninfected組和pAd組(P<0.05)。以上結(jié)果表明,SM22α過(guò)表達(dá)可以明顯抑制球囊損傷誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
3 SM22α過(guò)表達(dá)抑制血管壁PCNA的表達(dá),促進(jìn)p27的表達(dá)
免疫
7、組化結(jié)果顯示,球囊損傷14天時(shí),在uninfected組與pAd組中,PCNA陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)量及單細(xì)胞染色強(qiáng)度均較高并且主要分布在新生內(nèi)膜層;在pad-SM22α組中,PCNA在血管壁中陽(yáng)性棕色顆粒數(shù)量較少、顏色較淺。而p27的表達(dá)與之相反,在uninfected組與pAd組血管壁中,陽(yáng)性著色較淺;在pAd-SM22α組中的表達(dá)則是明顯增高。上述結(jié)果提示,SM22α過(guò)表達(dá)抑制球囊損傷后血管壁中PCNA的表達(dá),促進(jìn)p27的表達(dá)。
8、 4 SM22α過(guò)表達(dá)可抑制球囊損傷誘導(dǎo)的Raf-1、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化活化
Western blot結(jié)果顯示,與uninfected組和pAd組相比較,pAd-SM22α組中Raf-1、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平顯著下降,SM22α對(duì)ERK/MAPK途徑具有較強(qiáng)的抑制作用,而uninfected組與pAd組相比,上述三種蛋白磷酸化水平無(wú)顯著差異。結(jié)果提示,SM22α過(guò)表達(dá)抑制Raf-1、
9、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化活化。
結(jié)論:
1成功建立頸總動(dòng)脈腔內(nèi)感染pAd-SM22α腺病毒載體的模型。
2 SM22α過(guò)表達(dá)顯著抑制內(nèi)皮剝脫誘導(dǎo)的血管內(nèi)膜增生。
3外源性SM22α可下調(diào)增殖相關(guān)基因PCNA表達(dá)和上調(diào)細(xì)胞周期抑制因子p27表達(dá)。
4 SM22α過(guò)表達(dá)可抑制球囊損傷誘導(dǎo)的Raf-1、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化活化,通過(guò)阻斷Raf-1-M
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