SM22α調制血管氧化應激的機制和意義.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和肥大是高血壓、動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病的病理學基礎。腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活以及由此產(chǎn)生的血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)作為重要的信號分子參與介導了AngⅡ引發(fā)的諸多病理生理過程。VSMCs是血管ROS生成的主要來源，

2、NADPH氧化酶是催化ROS生成的關鍵酶，其活性受p47phox亞基的調節(jié)，后者在AngⅡ誘導的VSMC ROS合成中扮演重要角色。在心血管系統(tǒng)中，AngⅡ引發(fā)的分子和細胞事件幾乎都是通過血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensinⅡ type1receptors，AT1R)介導的。作為AT1R下游的信號分子，蛋白激酶C(PKC)是AngⅡ誘導的諸多胞內信號途徑交互聯(lián)系的關鍵樞紐，含有多種亞型。其中，PKC8是大鼠VSMC表達的主要亞型

3、之一。然而其在AngⅡ誘導的ROS生成中的作用尚不明確。
　　有關血管氧化應激的調節(jié)機制已有很多理論觀點，但是功能性蛋白在調控VSMC ROS合成中的作用和分子機制研究尚少。平滑肌22 alpha(smooth muscle22 alpha，SM22α)是一種actin相關蛋白，特異表達于成熟的SMC中。近期的研究表明，SM22α缺失可通過激活ROS介導的NF-κB途徑而參與血管炎癥反應。但其激活ROS產(chǎn)生的作用機制尚不清楚。

4、r>　　方法：本文假設，SM22α功能失調可能參與AngⅡ誘導的血管氧化應激。本研究從分子、細胞和整體水平上，考察AngⅡ對VSMCs中SM22α表達和功能的影響，以及與ROS生成、VSMC增殖和肥厚的關系；利用蛋白質相互作用分析技術，探討SM22α對PKC6-p47phox通路激活的影響及信號調節(jié)機制；進而，分別用血管肥厚模型和內膜增生模型驗證體外研究的發(fā)現(xiàn)。旨在為血管重塑性疾病的發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)，為心血管疾病的防治提供新的靶

5、點。
　　結果：
　　1 SM22α表達下調加劇AngⅡ誘導的VSMC氧化應激
　　1.1 AngⅡ引發(fā)的SM22α表達下調促進ROS的合成
　　Western blot結果表明，AngⅡ以時間依賴方式抑制SM22α表達，24h時抑制作用最強。DHE染色和TBA分析結果表明，AngⅡ誘導的ROS合成呈現(xiàn)雙峰模式，峰值分別出現(xiàn)在0.5-1 h和24 h。利用小干擾RNAsiSM22α特異性敲低VSMC內源性SM22

6、α后，ROS合成增加，而利用腺病毒Ad-GFP-SM22α感染VSMCs使外源性SM22α過表達后，ROS合成下降。結果表明，AngⅡ引發(fā)的SM22α表達下調促進了VSMC ROS的合成。
　　1.2 SM22α表達下調促進AngⅡ誘導的p47phox激活
　　免疫沉淀結果顯示，AngⅡ刺激VSMCs10 min，p47phox磷酸化達峰值；免疫熒光和亞細胞組分分離結果顯示，AngⅡ短時刺激可誘導胞漿p47phox發(fā)生膜轉位

7、。提示參與AngⅡ誘導的ROS合成。進一步分析顯示，敲低SM22α可促進AngⅡ誘導的p47pbox磷酸化，而過表達SM22α抑制該過程。結果表明，SM22α表達下調通過促進p47phox激活而增強AngⅡ誘導的ROS合成。
　　2 AngⅡ誘導的SM22α磷酸化是PKCδ-p47phox軸激活所必需的
　　2.1磷酸化SM22α介導PKCδ與p47phox的相互作用
　　為了揭示SM22α在AngⅡ誘導的p47pho

8、x快速磷酸化中的作用，基于SM22α分子中存在的三個可能磷酸化位點，首先檢測了AngⅡ短時刺激對SM22α磷酸化的影響。免疫沉淀結果顯示，AngⅡ刺激10-30 min時，SM22α磷酸化水平達到峰值。隨后，分別利用SM22α野生型、強制磷酸化突變體S181D、和磷酸化失活突變體S181A腺病毒感染細胞，結果顯示，SM22α和S181A，而不是S181D顯著抑制AngⅡ短時刺激引發(fā)的p47phox磷酸化和膜轉位，提示SM22α S181

9、磷酸化有利于p47phox活化。為了闡明SM22α調控p47phox活性的分子機制，進而檢測SM22α與p47phox和PKCδ的相互關系。免疫共沉淀結果顯示，靜息狀態(tài)下，SM22α與PKCδ結合。AngⅡ刺激10 min后，隨著PKCδ磷酸化激活，其與SM22α解離，轉而與p47phox相互作用，伴隨發(fā)生SM22α和p47phox磷酸化。免疫雙熒光定位分析也證實了這一點。
　　為了證實SM22α磷酸化促使其與PKCδ解離，分別將

10、野生型SM22α和磷酸化位點突變體S181D，S181A轉染293A細胞。免疫沉淀結果顯示，PKCδ與S181A的親和力明顯高于S181D；過表達SM22α或S181A，司明顯抑制PKCδ與p47phox的相互作用。GST-pull down結果進一步證實了上述發(fā)現(xiàn)。
　　為了確定SM22α在AngⅡ長效刺激誘導的氧化應激中的作用，用AngⅡ處理VSMC24 h，或利用siRNA敲低內源性SM22α，觀察對p47phox活性的影響

11、。免疫沉淀結果表明，AngⅡ長效刺激或敲低SM22α表達均促進PKCδ與p47phox相互作用和p47phox激活。
　　結果表明，SM22α Ser181磷酸化或表達下調分別參與AngⅡ誘導的快速和遲發(fā)的氧化應激，其作用機制與促進PKCδ-p47phox途徑激活有關。
　　2.2 AT1R-PKCδ途徑介導AngⅡ誘導的SM22αS181磷酸化
　　為了揭示介導SM22α S181磷酸化的上游信號通路，分別以AT1R

12、拮抗劑纈沙坦、PKC激動劑佛波酯和抑制劑十字苞堿、PKCα/B選擇性抑制劑Go6976、PKCδ選擇性抑制劑Rottlerin或PKCδ特異性小干擾RNA處理VSMCs。結果顯示，AngⅡ通過AT1R激活PKCδ，后者參與介導了AngⅡ誘導的SM22α S181磷酸化。上述發(fā)現(xiàn)表明，SM22α是PKCδ的一個新的作用底物。
　　2.3 SM22α下調可通過細胞骨架動力學而促進PKCδ-p47phox軸激活
　　為探討SM22

13、α調制AngⅡ長效刺激誘導ROS生成的作用機制，本研究首先考察AngⅡ長效刺激對SM22α泛素化降解的影響。免疫沉淀結果表明，AngⅡ能以時間依賴的方式促進SM22α泛素化，4 h時泛素化水平最高。PKCδ選擇性抑制劑Rottlerin可明顯削弱AngⅡ引發(fā)的SM22α泛素化；重組腺病毒感染分析顯示，與S181D相比，S181A顯著抑制AngⅡ誘導的SM22α泛素化；293A細胞株轉染分析得到相似的結果。上述發(fā)現(xiàn)表明，AngⅡ通過誘導S

14、M22α磷酸化而加速其泛素化降解。
　　為了確定SM22α缺失對細胞骨架動力學的影響，分步提取G-actin和F-actin，Western blot結果顯示，AngⅡ刺激VSMCs24 h后，隨著SM22α水平的降低，F(xiàn)-actin/G-actin比值下降，表明AngⅡ長期刺激能促進細胞骨架解聚。為了進一步證實細胞骨架動力學對ROS合成的影響，分別以細胞松弛素B處理VSMCs。免疫沉淀結果表明，細胞骨架解聚促進PKCδ-p47p

15、hox軸激活以及p47phox的活化，而細胞骨架穩(wěn)定劑JPK抑制了該過程。結果表明，AngⅡ長效刺激導致的SM22α下調可通過加速細胞骨架解聚而促進PKCδ-p47phox軸激活和ROS生成。
　　3 SM22α磷酸化介導的ROS生成參與VSMC肥大和增殖的調節(jié)
　　3.1 SM22α磷酸化與VSMC增殖和肥大成正相關關系
　　5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU)摻入和單位細胞蛋白含量分析結果顯示，SM22α磷酸化促進An

16、gⅡ誘導的VSMC增殖和肥大；反之，抑制SM22α磷酸化，則可在一定程度上降低細胞增殖和肥大活性。
　　3.2 SM22α磷酸化在血管肥厚和內膜增生中發(fā)揮重要作用
　　將含有AngⅡ的Alzet微滲透泵植入大鼠皮下，持續(xù)給予AngⅡ刺激，建立大鼠高血壓模型；同時，在體頸總動脈分別導入SM22α、S181D和S181A，觀察對AngⅡ誘發(fā)的血管肥大和ROS生成的影響。模型成功后，取頸總動脈切片，HE染色結果顯示，Ad-GFP-

17、SM22α和Ad-GFP-S181A組的血管中膜增厚及橫截面積增大程度明顯減弱；免疫組化染色可見，氧化應激的標志物4-HNE也明顯減少。結果表明，過表達SM22α或抑制其磷酸化可抵抗AngⅡ誘發(fā)的血管肥大及ROS合成。利用大鼠頸總動脈球囊損傷模型，同樣發(fā)現(xiàn)過表達SM22α和非磷酸化突變體S181A可抑制球囊損傷誘導的血管ROS合成及新生內膜形成。
　　總之，SM22α通過調制氧化應激而在VSMC肥大和增殖中發(fā)揮關鍵作用。靶向SM2