miR-29a在膿毒癥中靶向STAT3促進單核細胞凋亡機制的研究.pdf

1、背景
　　膿毒癥為機體感染所導致的全身炎癥反應綜合征，其英縮寫為SIRS，膿毒癥患者處于發(fā)病期間，其全身各種組織器官共同參與這一過程。這種疾病在致使重癥監(jiān)護室患者死亡方面排在全球的首位，嚴重威脅患者生命健康，同時亦給社會和家庭帶來了巨大經(jīng)濟壓力，同時生物機體的免疫反應亦在該過程中扮演著重要角色。在膿毒癥發(fā)生時，機體同時存在免疫抗擊以及免疫抑制，兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。除此之外，抗炎以及促炎反應亦參與了膿毒癥的發(fā)生。膿毒癥發(fā)生的臨床表

2、現(xiàn)往往呈現(xiàn)出多樣性，即沒有其標志性的臨床表現(xiàn)，因此越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到尋找膿毒癥特異性生物學標志物的研究上來，以期將之應用于膿毒癥的臨床診斷、治療以及預后評價中。迄今為止，已有多種膿毒癥相關(guān)分子標志物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其中包括與凝血和炎癥反應相關(guān)的分子標志物，如C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、降鈣素原等，目前這些分子標志物已有部分被應用于臨床。但在目前所使用的上述分子標志物中均存在敏感性過高以及特異性不強等

3、缺點，因此應用于診斷膿毒癥往往結(jié)果并不理想;評分系統(tǒng)雖然能夠用于對膿毒癥患者的預后情況以及病情的嚴重程度進行評價，但卻不能應用于膿毒癥的診斷，同時亦不能夠應用于膿毒癥的治療當中。所以尋找新的膿毒癥診斷、治療以及判斷預后的分子標志物成為目前醫(yī)學界亟待解決的問題。
　　miRNA為一類非編碼小RNA分子，成熟miRNA的長度為18～25個核苷酸，通過生物機體可以快速識別特定目標的mRNA，全面調(diào)控mRNA的降解，還可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控其翻譯過

4、程。生物機體中miRNA與一系列生命活動過程相關(guān)，其中包括細胞的生長、增殖、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及機體免疫等。目前已有大量研究證實，miRNA與膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。miR-29為一類miRNA，在人體的肺、腎臟、心臟等組織細胞中呈高表達狀態(tài)。miR-29a為miR-29家族中的重要成員之一，其在生物機體一系列生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，但目前尚未有miR-29a與膿毒癥發(fā)生和發(fā)展相關(guān)性的研究。
　　STATs，即以激

5、活因子為中心，進行信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄，屬于由酪氨酸蛋白激酶活化的轉(zhuǎn)錄因子，存在于細胞漿中，具有介導細胞反應性以及增生性信號的功能。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路中的主要成員包括JAKs以及STATs蛋白家族。目前的研究已經(jīng)證實，STATs蛋白家族為JAKs的底物，STAT能夠通過促進炎癥介質(zhì)的表達從而影響膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展。STATs蛋白家族能夠通過介導多種細胞因子的表達，從而調(diào)控生物機體中一系列生理過程，其中包括細胞生長、分化、增殖以及凋亡

6、等。STAT3為STATs家族的重要成員之一，在生物機體中STAT3相關(guān)信號轉(zhuǎn)導通路與多種生長因子以及細胞因子介導的信號轉(zhuǎn)導過程之間存在密切聯(lián)系，從而參與了一系列生理和病理過程。STAT3能夠通過調(diào)控相應靶基因，以便加速細胞增殖、有效組織細胞凋亡的速度，改善細胞惡變的現(xiàn)象。不同的JAK/STAT信號通路在膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展過程中往往會具有不同作用，其中JAK2/STAT3通路在膿毒癥引起的多器官功能障礙的發(fā)展過程中扮演著十分重要的角色。

7、通過人為手段阻斷JAK2/STAT3信號通路能夠進而阻斷膿毒癥發(fā)生過程中引起的過激炎癥反應，此外還能同時抑制機體過度抗炎反應的發(fā)生，最終發(fā)揮保護組織器官的功能。
　　目的
　　本研究擬通過檢測miR-29a在膿毒癥患者外周血白細胞中的表達，探討其與膿毒癥患者預后以及血清中炎性因子的相關(guān)性，同時分析miR-29a表達的改變對LI-10誘導的人外周血單核細胞系THP-1增殖、凋亡以及細胞周期的影響;除此之外，我們還利用生物信息學

8、軟件對miR-29a的靶基因進行預測并進行驗證。本研究旨在旨在為了解miR-29a在膿毒癥發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制，同時為膿毒癥的臨床診斷，進行靶向治療給予強大的后援。
　　方法
　　(1)選取2015年8月至次年8月期間于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護室(intensive careunit, ICU)收治的膿毒癥患者外周血樣本為對象，共40例;采集同期于XXX醫(yī)院重癥監(jiān)護室(ICU)收治的SIRS患者外周血樣本，共35例;同時采集

9、10例同期于XXX醫(yī)院門診進行健康檢查的健康志愿者外周血樣本，共10例。熒光定量PCR檢測上述血液樣本中mIR-29a的表達水平，ELISA法檢測血清中IL-10和TNF-α的含量。分析miR-29a與IL-10、TNF-α的相關(guān)性。
　　(2) ELISA法檢測不同患者來源的單核細胞以及用20 ng/mL LPS作用后的THP-1細胞中IL-10蛋白的表達情況。設計并合成miR-29a inhibitor，將之轉(zhuǎn)染THP-1細胞

10、用以抑制細胞中miR-29a的表達。熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞中miR-29a的表達量。用20 ng/mL LPS作用于轉(zhuǎn)染后的THP-1細胞，MTT法檢測細胞的增殖活性，Hoechst染色法檢測細胞的凋亡率。
　　(3)將LPS(20 ng/ml)和LPS+ IL-10(10 ng/mL)分別作用于THP-1細胞，MTT法檢測細胞的存活率，流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率;western blot法檢測細胞中STAT3和p-STAT

11、3蛋白的表達。運用生物信息學軟件對miR-29a的靶基因進行預測。分別構(gòu)建STAT33'UTR WT（野生型）和STAT33'UTR Mut（突變型）質(zhì)粒載體并將之分別與miR-29a mimic共轉(zhuǎn)染HTP-1細胞，檢測細胞中熒光素酶報告基因的表達。將miR-29amimic分別轉(zhuǎn)染來自于健康志愿者外周血的單核細胞以及培養(yǎng)的人單核細胞THP-1，采用熒光定量PCR和western blot法分別檢測上述細胞中STAT3 mRNA和蛋白

12、的表達。將miR-29a和/或STAT3慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細胞，隨后用20 ng/ml LPS作用于上述細胞，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞的凋亡率，MTT法檢測細胞的存活率。
　　結(jié)果
　　(1)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，對照組患者血漿中miR-29a的相對表達量為0.235±0.110、膿毒癥組患者為0.733±0.126、SIRS組患者為0.419±0.093。與對照組相比，膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達水平

13、明顯增高(t=3.122，P=0.035＜0.05);與對照組相比，SIRS組患者血漿中miR-29a的表達水平明顯增高(t=2.091，P=0.044＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血漿中miR-29a的表達水平明顯增高(t=2.322，P=0.046＜0.05)。ELISA檢測結(jié)果表明，對照組患者血清中IL-10的表達量為（233.175±25.624）pg/mL、膿毒癥組患者為(549.367±30.098)pg/

14、mL、SIRS組患者為（331.119±29.033）pg/mL。與對照組相比，膿毒癥組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=4.355，P=0.029＜0.05);與對照組相比，SIRS組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=3.761，P=0.041＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血清中IL-10的表達水平明顯增高(t=2.716，P=0.043＜0.05)。對照組患者血清中TNF-α的表達量為（189.

15、233±19.259）pg/mL、膿毒癥組患者為（411.189±24.106）pg/mL、SIRS組患者為（290.611±22.735）pg/mL。與對照組相比，膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=6.811，P=0.023＜0.05);與對照組相比，SIRS組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=4.655，P=0.038＜0.05);與SIRS組患者相比，膿毒癥組患者血清中TNF-α的表達水平明顯增高(t=

16、4.316，P=0.044＜0.05)。miR-29a與IL-10呈正相關(guān)(r=0.407，P=0.041＜0.05);對膿毒癥患者外周血中miR-29a的表達與TNF-α含量之間的相關(guān)性進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果表明miR-29a與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.576，P=0.038＜0.05)。
　　ELISA檢測結(jié)果表明，與對照組相比，各膿毒癥患者單核細胞中IL-10的表達量均明顯增高(P＜0.05)。采用ELISA法對用20 ng

17、/mL LPS作用后THP-1細胞在0、4、8、12h時IL-10的表達水平進行檢測，結(jié)果表明隨著時間的推移，LPS作用后人單核細胞THP-1中IL-10的表達水平逐漸增高。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與control組相比，miR-29a inhibitor組細胞含有miR-29a表達能力呈現(xiàn)下降趨勢(P＜0.05)，已經(jīng)順利建立了THP-1細胞，可以對miR-29a起到表達抑制的效果。經(jīng)過MTT法可以發(fā)現(xiàn)，較之于照組顯而言，THP-

18、1細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor以后，其分別于48 h、72 h、96 h的組織率得到很大的提升(P＜0.05)。Hoechst染色法檢測結(jié)果表明，miR-29a inhibitor組細胞凋亡率明顯低于對照組組(P＜0.01)。
　　(2)隨著時間的延長，對照組和IL-10作用組細胞中細胞的存活率均逐漸增高;其中相較于對照組，IL-10處理組細胞各時間點的存活率明顯高于對照組(P＜0.05)。與對照組相比，IL-1

19、0作用組細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。隨著時間的推移，STAT3和p-STAT3蛋白的表達水平逐漸增高。生物信息學軟件預測結(jié)果表明，STAT3為miR-29a的靶基因。與對照組相比，miR-29a mimic與STAT33'UTR WT共轉(zhuǎn)染組已經(jīng)在不斷降低其熒光素酶表達量(P＜0.05);與對照組對比，miR-29a mimic與STAT33'UTR Mut共轉(zhuǎn)染組，兩者的熒光素酶表達量基本不變(P＞0.05)。
　　在分

20、離自健康志愿者外周血的單核細胞中，當miR-29a表達上調(diào)后能夠明顯抑制細胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(P＜0.05);在培養(yǎng)的人單核細胞THP-1中，當miR-29a表達上調(diào)后能夠明顯抑制細胞中STAT3 mRN和蛋白的表達(P＜0.05)。與miR-control組相比，miR-29a組細胞的凋亡率明顯增高(P＜0.05);而miR-control+STAT3組細胞的凋亡率則明顯降低(P＜0.05);而miR-29a+STAT

21、3組細胞的凋亡率與miR-control組相比無顯著差異(P＞0.05)。miR-29a組在1、3、4、5天時細胞的存活率明顯低于miR-control組(P＜0.05); miR-control+STAT3組細胞的存活率明顯高于miR-control組(P＜0.05);而miR-29a+STAT3組與miR-control組相比無明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　miR-29a在膿毒癥患者外周血中呈高表達狀態(tài)，其能