MicroRNA-491靶向作用EGFR通過STAT3信號通路在肝細(xì)胞癌腫瘤干細(xì)胞特性中作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　闡述miR-491對肝癌腫瘤干細(xì)胞特性獲得的分子調(diào)控機(jī)制及其對肝細(xì)胞肝癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的影響，為今后肝癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后復(fù)發(fā)的診斷、靶向治療以及患者預(yù)后預(yù)測提供新的途徑和研究思路。
　　方法:
　　一、miR-491在腫瘤組織、正常組織的表達(dá)與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的相關(guān)關(guān)系
　　1.肝癌組織與正常組織miRNA-491表達(dá)差異檢測:實(shí)時(shí)定量轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法檢測miRNA-491在腫瘤組織

2、和正常組織中的表達(dá);
　　2.肝癌細(xì)胞miR-491和檢測:實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)方法檢測miR-491在不同轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平;
　　二、miR-491影響肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得
　　miR-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞集落形成能力及腫瘤干細(xì)胞成球能力影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H和HepG2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染miR-491-mimic/inhibitor，腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)及懸浮克隆細(xì)胞球

3、形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤干細(xì)胞性的變化。
　　三、miR-491在肝癌細(xì)胞系中通過EGFR調(diào)控STAT3
　　1.miR-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞EGFR和STAT3表達(dá)影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H和HepG2內(nèi)分別轉(zhuǎn)染miR-491-mimic/inhibitor，Western blot檢測EGFR和STAT3蛋白及磷酸化水平變化;
　　2.miR-491表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞EGFR的影響檢測:肝癌細(xì)胞MHCC9

4、7H細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor,熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測EGFR熒光素酶活性變化;
　　3.EGFR表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞STAT3的影響檢測:肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor24 h后，繼續(xù)用EGFR siRNA處理細(xì)胞12h，Western blot

5、檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化，肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic24 h后，繼續(xù)用EGFR高表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞12h，Westem blot檢測EGFR和STAT3蛋白水平變化。
　　四、EGFR/STAT3對肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得及侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　1.EGFR/STAT3表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力影響及腫瘤細(xì)胞集落形成能力檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-m

6、imic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒和肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，懸浮克隆細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)及集落形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤干細(xì)胞成球能力變化。
　　2.EGFR/STAT3表達(dá)水平變化對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測:肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒和肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3siRNA，trans

7、well實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力變化。
　　結(jié)果:
　　一、miR-491和肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能和腫瘤組織相關(guān)
　　qRT-PCR方法分別檢測肝癌細(xì)胞系和肝癌組織、正常組織miR-491表達(dá)水平結(jié)果發(fā)現(xiàn):miR-491表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，在肝癌組織中表達(dá)遠(yuǎn)低于正常組織。
　　二、miR-491影響肝癌細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性獲得結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic的MHCC97H細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力較對照組

8、顯著降低;而轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor的HepG2細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞成球能力較對照組明顯升高。
　　三、miR-491在肝癌細(xì)胞系中通過EGFR調(diào)控STAT3
　　1.在肝癌細(xì)胞MHCC97H中上調(diào)miR-491后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白水平明顯降低，STAT3蛋白磷酸化水平均明顯降低;而肝癌細(xì)胞HepG2下調(diào)miR-491后，EGFR蛋白水平明顯升高，STAT3蛋白磷酸化水平明顯升高;
　　2.肝癌細(xì)胞MHCC

9、97H內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR3'UTR-Luc和miR-491-mimic，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與miR-491啟動(dòng)子區(qū)能夠結(jié)合，上調(diào)miR-491水平， EGFR熒光素酶活性下降，肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)共轉(zhuǎn)染pEGFP-EGFR-3'UTR-Luc和miR-491-inhibitor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR與miR-491啟動(dòng)子區(qū)能夠結(jié)合，下調(diào)miR-491水平，EGFR熒光素酶活性上升。說明在肝癌細(xì)胞中，miR-491可以直接靶向調(diào)控EG

10、FR;
　　3.使用miR-491-inhibitor處理HepG2細(xì)胞后，再用EGFR siRNA處理HepG2細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制EGFR可使miR-491所致HepG2細(xì)胞STAT3的蛋白磷酸化水平升高回降;使用miR-491-mimic處理MHCC97H細(xì)胞后，再用EGFR高表達(dá)質(zhì)粒處理細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)EGFR可使miR-491所致MHCC97H細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化水平降低回升。說明miR-491所致肝癌細(xì)胞ST

11、AT3表達(dá)水平變化是通過EGFR來完成的。
　　四、miR-491/STAT3對肝癌細(xì)胞干細(xì)胞特性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響
　　1.肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力亦明顯減弱，共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)STAT3可使miR-491-mimic所致腫瘤于細(xì)胞成球能力及集落形成減弱回高;肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-i

12、nhibitor后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力明顯升高，共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)STAT3可使miR-491-inhibitor所致腫瘤干細(xì)胞成球及集落形成能力能力升高回降。
　　2.肝癌細(xì)胞MHCC97H內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-mimic后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯減弱，共轉(zhuǎn)染miR-491-mimic及STAT3高表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)STAT3可使mi

13、R-491-mimic所致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱回高;肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯升高，共轉(zhuǎn)染miR-491-inhibitor及STAT3 siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)STAT3可使miR-491-inhibitor所致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力升高回低。
　　結(jié)論:
　　1.miR-491和腫瘤細(xì)胞惡性程度及肝癌分期相關(guān);
　　2.miR-491在肝癌細(xì)胞