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文檔簡介
1、目的:通過體外實驗研究葦莖湯及其拆方對人肺腺癌A549細胞活性、凋亡及其相關(guān)信號通路EGFR、STAT3的影響,為葦莖湯的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
方法:采用MTT法檢測不同劑量(低劑量、中劑量、高劑量)葦莖湯全方及其拆方清肺化痰方(葦莖)、滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)和活血化瘀方(桃仁)對人肺腺癌A549細胞生長的抑制作用;以倒置顯微鏡觀察葦莖湯及其拆方對肺癌細胞的形態(tài)學(xué)影響;以熒光顯微鏡結(jié)合AO∕EB和DAPI熒光染色觀察葦莖
2、湯及其拆方對肺癌細胞凋亡的形態(tài)學(xué)影響;利用流式細胞術(shù)檢測細胞周期,測定細胞凋亡率;應(yīng)用Western blot和實時熒光定量RT-PCR技術(shù)分別從蛋白和基因兩個層面檢測葦莖湯及其拆方對A549細胞中凋亡信號通路EGFR、STAT3的影響。
結(jié)果:
1.MTT法檢測結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,不同劑量葦莖湯及其拆方作用24h、48h、72h后,A549細胞OD值均出現(xiàn)不同程度的下降,且細胞抑制率具有時間-劑量依賴性;相
3、同劑量(中劑量)葦莖湯及其拆方作用A549細胞24h、48h、72h后,各拆方對細胞的抑制作用以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
2.倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,均能使A549細胞發(fā)生不同程度的形態(tài)學(xué)改變,各拆方對細胞的作用以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最
4、弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
3.AO∕EB熒光染色結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,A549細胞的數(shù)量減少,亮度增強,甚至出現(xiàn)大量橘紅色、固縮狀的凋亡細胞;對A549細胞凋亡形態(tài)的影響以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆。
4.DAPI熒光染色觀察發(fā)現(xiàn),與陰性對照組相比,中劑量(2.5g·L-1)葦莖
5、湯及其拆方作用48h后,A549細胞的亮度增強,細胞核形態(tài)發(fā)生改變,染色質(zhì)出現(xiàn)聚集、邊緣化;對A549細胞凋亡形態(tài)的影響以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
5.流式細胞術(shù)檢測細胞周期結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,G0∕G1期A549細胞數(shù)量顯著增加(P<0.01),S期和G2∕M期的細胞數(shù)量減少。
6、r> 6.流式細胞術(shù)測定細胞凋亡結(jié)果顯示,與陰性對照組相比,中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,除滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)外,其余各組A549細胞的早期凋亡率均高于陰性對照組(P<0.05)。
7.Western Blot結(jié)果顯示,中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,A549細胞中凋亡相關(guān)蛋白EGFR、STAT3的表達水平均出現(xiàn)不同程度的下降,其中以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血
7、化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
8.實時熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,中劑量(2.5g·L-1)葦莖湯及其拆方作用48h后,A549細胞中凋亡相關(guān)基因EGFR,STAT3的表達出現(xiàn)不同程度的下調(diào),其中以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
結(jié)論:
1.葦莖湯及其拆方均能抑制A549細胞的生長,使其
8、發(fā)生不同程度的形態(tài)學(xué)改變,其抑制率具有時間-劑量依賴性;各拆方對A549細胞的抑制作用以清肺化痰方(葦莖)最為明顯,其次是活血化瘀方(桃仁),滲濕化痰方(薏苡仁+瓜瓣)最弱,葦莖湯全方優(yōu)于各拆方。
2.葦莖湯及其拆方可能通過影響EGFR,STAT3信號通路誘導(dǎo)A549細胞凋亡,使其發(fā)生不同程度的凋亡形態(tài)學(xué)改變,并將其阻滯于G0∕G1期;細胞凋亡、細胞周期、EGFR和STAT3信號通路均是葦莖湯及其拆方抑制肺癌細胞生長的重要靶點
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