反義STAT3設(shè)計(jì)及其對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞輻射敏感性影響的研究.pdf

1、本課題選擇近年來國際上高度關(guān)注、極有可能成為反義核酸抗腫瘤關(guān)鍵作用的sTAT3作為基因靶位，利用RNAstructure 4.2 軟件和網(wǎng)絡(luò)資源，模擬STAT3mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊設(shè)計(jì)出一系列反義序列，聯(lián)合輻射因素，觀察其對(duì)腫瘤輻射敏感性的影響，并以文獻(xiàn)報(bào)道的已知序列作為陽性對(duì)照，篩選出高效的反義STAT3序列。在此基礎(chǔ)上，探討反義STAT3削弱腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的相關(guān)機(jī)制，研究將分子生物

2、學(xué)手段與傳統(tǒng)放射治療手段聯(lián)合應(yīng)用治療輻射抗性腫瘤的可行性。 研究內(nèi)容： 第一，STAT3反義序列的設(shè)計(jì)：利用RNAstructure 4.2 軟件和網(wǎng)絡(luò)資源，模擬STFAT3 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊，針對(duì)低自由能靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一系列反義序列，并合成、修飾增強(qiáng)其穩(wěn)定性。 第二，高效STAT3反義序列的篩選：以文獻(xiàn)報(bào)道的已知反義STAT3序列作為陽性對(duì)照，對(duì)上述反義序列進(jìn)行篩

3、選，篩選出更高生物學(xué)活性的STAT3反義序列。 第三，探討高效反義STAX3轉(zhuǎn)染后細(xì)胞輻射抗性的變化及其作用規(guī)律：將篩選出的高效STAT3反義序列轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，體外觀察細(xì)胞輻射敏感性的變化，尋求其作用規(guī)律。 第四，研究反義STAT3削弱腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的相關(guān)機(jī)制：通過觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)、凋亡狀況、細(xì)胞周期的變化、STAT3表達(dá)和活力變化、下游相關(guān)基因的表達(dá)變化，初步闡明反義STAT3對(duì)細(xì)胞輻射敏感性的影響的相關(guān)機(jī)理。

4、 實(shí)驗(yàn)方法：用RNAstructure 4.2軟件和網(wǎng)絡(luò)資源，模擬STAT3 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步利用軟件的步移法(oligowalk)模塊，針對(duì)低自由能靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一系列反義序列，并合成、修飾增強(qiáng)其穩(wěn)定性，以文獻(xiàn)報(bào)道的已知反義STAT3序列作為陽性對(duì)照，脂質(zhì)體包裹各反義序列，在96孔板以200nmol/L濃度為轉(zhuǎn)染濃度，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后，用CCK-8實(shí)驗(yàn)方法觀察各序列對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果，篩選出更加高效的反義序列。進(jìn)一

5、步利用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀研究高效反義序列對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果，利用Hoeclast33258染色對(duì)各種因素作用后的細(xì)胞作形態(tài)學(xué)上的初步觀察，判別凋亡細(xì)胞數(shù)量變化的趨勢；用Annexin V/PI復(fù)染，流式細(xì)胞儀檢測不同因素處理后細(xì)胞凋亡百分率的變化，用PI單染分析反義轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化，研究反義STAT3對(duì)惡性腫瘤輻射敏感性的改變情況，觀察兩者的協(xié)同效應(yīng)。通過蛋白雜交研究轉(zhuǎn)染STAT3蛋白表達(dá)與活化水平以及相關(guān)下游基因的變化，

6、觀察反義序列對(duì)蛋白表達(dá)和活化的阻斷作用，對(duì)反義序列改變腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的機(jī)制作初步的探討。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、反義STAT3序列的設(shè)計(jì)與合成利用先進(jìn)的反義序列設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)得到10條新的反義STAT3序列，分別命名為AS1～AS10，他們的總自由能介于-9.6～-25.8之間，皆明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的已知序列ASC。 2、新反義STAT3序列對(duì)A549細(xì)胞的作用2.1 對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果：以文獻(xiàn)報(bào)道的已知序列AS

7、C作為陽性對(duì)照，CCK-8檢測AS1～AS10各序列對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果。發(fā)現(xiàn)AS5～AS7三個(gè)組對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果與ASC組的作用相當(dāng)，無顯著差異(P>0.05)，其余7組對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果明顯優(yōu)于ASC組(P<0.01)，其中AS10組效果最好，增殖抑制率達(dá)75.64％，比ASC組的增殖抑制率提高了近4倍。而AS4與AS8的增殖抑制率也分別達(dá)到65.88％、65.97％。 3、不同濃度AS10對(duì)A

8、549細(xì)胞的增殖抑制效果選擇不同濃度最優(yōu)序列AS10，與已知序列Asc和無義序列NS作A549細(xì)胞的增殖抑制效果比較，通過CCK-8檢測計(jì)算各組的存活分?jǐn)?shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明：(1)ASlO對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果顯著由于AS10。在50～300nmol/L范圍內(nèi)，相同濃度的AS10序列的抑制率非常顯著高于相同濃度的ASC序列(JP<0.01)。(2)AS10對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果隨濃度增高而增強(qiáng)。在0到150nmol/L范圍內(nèi)

9、，反義核酸濃度越高，其增殖抑制效應(yīng)越強(qiáng)(P<0.01)。 4、反義STAT3轉(zhuǎn)染聯(lián)合輻射作用對(duì)A549細(xì)胞輻射敏感性的影響 5、反義STAT3對(duì)A549細(xì)胞抑制作用的機(jī)理探討 討論： STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道的匯聚的焦點(diǎn)，調(diào)節(jié)下游多個(gè)靶基因如Bcl-x<,L>、Bcl-2、Mcl-1、c-Myc、VEGF、p<'21WAF\CIP1>、CyclinD1

10、等的表達(dá)，在多種腫瘤細(xì)胞和組織中都有激活，是近年來備受國內(nèi)外備受關(guān)注的一個(gè)重要基因靶點(diǎn)。反義技術(shù)研究最重要的是要找準(zhǔn)關(guān)鍵基因靶點(diǎn)和獲得高效反義寡核苷酸序列。 因此，高效反義STAT3寡核苷酸能夠抑制A549的增殖和促進(jìn)其凋亡，增加腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，有利于在較低的輻射劑量下殺死更多的腫瘤細(xì)胞。其機(jī)制一方面是反義STAT3寡核苷酸阻斷細(xì)胞中STAT3信號(hào)通路后，其下游的多種基因表達(dá)受到調(diào)控，發(fā)生了相應(yīng)的變化，下調(diào)了其下游的抗凋亡

11、基因Bcl-x<,L>等，促進(jìn)了凋亡的發(fā)生，加上電離輻射對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生了協(xié)同疊加的效應(yīng)，增加了輻射抗性腫瘤的輻射敏感性。另一方面是反義STAT3下調(diào)了細(xì)胞周期控制基因，如CyclinD1等，加之輻射導(dǎo)致的DNA損傷，使細(xì)胞不能通過G<,1>期的檢查點(diǎn)，發(fā)生周期阻滯，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生了增殖抑制效應(yīng)。由于已有報(bào)道說阻斷STAT3對(duì)正常的細(xì)胞生長的幾乎沒有影響，因此，靶向STAT3蛋白在輻射增敏領(lǐng)域的研究可能具