RNA干擾STAT3基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞放射敏感性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究通過(guò)構(gòu)建STAT3基因siRNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞，特異性阻斷STAT3基因的表達(dá)，聯(lián)合不同劑量的X線照射，觀察放射合并RNA干擾對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和放射增敏性的影響，初步探討其放射增敏機(jī)制，為尋找食管癌的放射增敏靶點(diǎn)、提高食管癌的放療療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、免疫細(xì)胞化學(xué)法、Westernblot方法檢測(cè)食管癌Eca-109細(xì)胞中STAT3蛋白表達(dá)。 2、針對(duì)人ST

2、AT3基因mRNA序列，構(gòu)建3個(gè)siRNA重組質(zhì)粒：pRNAT-U6.1-siRNA1、pRNAT-U6.1-siRNA2、pRNAT-U6.1-siRNA3，同時(shí)構(gòu)建1個(gè)陰性重組質(zhì)粒：pRNAT-U6.1-negative。重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定。 3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞克隆，RT-PCR、Westernblot方法檢測(cè)細(xì)胞STAT3mRNA及蛋白表達(dá)。 4、MTT法、流

3、式細(xì)胞儀分別檢測(cè)STAT3-siRNA對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響。 5、Eca-109細(xì)胞分別接受0、2Gy、4Gy、6Gy、8GyX線照射，MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡。 6、穩(wěn)定表達(dá)siRNA的細(xì)胞分別接受0、2Gy、4Gy、6Gy、8GyX線照射，MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)4GyX線照射的細(xì)胞周期和凋亡。 結(jié)果：

4、 1、細(xì)胞免疫化學(xué)法和Westernblot方法檢測(cè)證實(shí)，食管癌Eca-109細(xì)胞中有STAT3蛋白表達(dá)。 2、成功構(gòu)建了3個(gè)STAT3基因siRNA重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確。 3、RT-PCR、Westernblot方法分析顯示，轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siRNA3重組質(zhì)?？擅黠@抑制腫瘤細(xì)胞STAT3mRNA和蛋白的表達(dá)，而pRNAT-U6.1-siRNA1和pRNAT-U6.1-siRNA2重組質(zhì)粒對(duì)STAT3基

5、因的抑制作用不明顯。 4、MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)，siRNA3治療組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為35.68％，明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)，siRNA3治療組G0/G1期細(xì)胞占79.51％，較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；細(xì)胞凋亡率為13.26％，較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 6、6Gy、8GyX線照射，Eca-109細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)分別為44

6、.28％、16.74％，較2Gy、4GyX線照射明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 7、4Gy、6Gy、8GyX線照射，Eca-109細(xì)胞中G2/M期細(xì)胞分別占11.7％、14.08％、24.27％，較0、2GyX線照射明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。不同劑量X線照射引起的細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。 8、不同劑量X線照射，siRNA3治療組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(p<0.01)。 9、4GyX線照射，siRNA3治療組G0/G1期細(xì)胞占83.79％，較對(duì)照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；細(xì)胞凋亡率為16.42％，較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。 10、經(jīng)計(jì)算本研究的放射增敏比為1.334，提示RNA干擾STAT3基因?qū)Ψ派溆性雒糇饔谩?結(jié)論： 1、食管癌Eca-109細(xì)胞中有STAT3蛋白表達(dá)。 2、成功構(gòu)建了3個(gè)STA

8、T3基因siRNA重組質(zhì)粒pRNAT-U6.1-siRNA，經(jīng)測(cè)序鑒定正確。 3、pRNAT-U6.1-siRNA3重組質(zhì)粒能有效地抑制腫瘤細(xì)胞STAT3mRNA和蛋白的表達(dá)。 4、STAT3-siRNA可抑制Eca-109細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞周期G0/G1期阻滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。 5、單純照射可抑制Eta-109細(xì)胞的增殖、引起細(xì)胞周期G2/M期阻滯，但是未誘導(dǎo)明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡。 6、放射合并STAT