QIC1抑制EGFR-STAT3-HKⅡ信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)對(duì)人類腫瘤增殖具有重要作用，是癌癥治療的有效靶目標(biāo)。本研究將對(duì)以EGFR為靶點(diǎn)合成的20種新的喹諾酮-吲哚酮衍生物單體進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，獲得活性最強(qiáng)的化合物，并研究其作用機(jī)制及其對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞的影響。
　　方法：MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)法篩選20種喹諾酮-吲哚酮衍生物單體對(duì)人類肝癌HepG-2細(xì)胞、人類乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人類肺腺癌A549細(xì)胞及人類宮

2、頸癌 Hela細(xì)胞的活性，獲得抗腫瘤活性最強(qiáng)的單體成分；流式細(xì)胞儀檢測(cè)該單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響；高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)分析該單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting檢測(cè)該單體化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞中EGFR、p-EGFR、STAT3、 p-STAT3、HKⅡ蛋白及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1、從20種喹諾酮-吲哚酮衍生物單體中篩選出抗腫瘤活性最強(qiáng)的單體成分--QIC1{9-氟-

3、3-甲基-10-(4-甲基哌嗪-1-基)-6-[(Z)-(2-羰基-1，2-二氫-3H-吲哚-3-亞甲基)甲基]-2，3-二氫-7H-[1，4]氧雜聯(lián)氮基[2，3，4-ij]喹啉-7-酮}。
　　2、QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7、A549細(xì)胞的抗增殖作用明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照蘇尼替尼(Sunitinib)。QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7、A549細(xì)胞作用48h的IC50分別為：2.44±0.63μmol/L、1.85±0.54

4、μmol/L、2.69±0.03μmol/L；陽(yáng)性對(duì)照Sunitinib對(duì)HepG-2、MCF-7、A549作用48 h的IC50分別為：16.66±0.93μmol/L、17.96±1.13μmol/L、8.77±1.38μmol/L。
　　3、而 QIC1對(duì)正常肝細(xì)胞 QSG7701(IC50=17.91±0.14μmol/L)的毒性與陽(yáng)性對(duì)照Sunitinib(IC50=17.00±0.16μmol/L)對(duì)正常肝細(xì)胞QSG7

5、701的毒性相似。
　　4、QIC1阻滯HepG-2細(xì)胞周期于G2/M期，且呈劑量依賴性；QIC1使A549細(xì)胞S期細(xì)胞減少，可能抑制A549細(xì)胞DNA的合成。
　　5、QIC1可呈劑量依賴性地誘導(dǎo)HepG-2、A549及MCF-7細(xì)胞凋亡，可促使Bax表達(dá)增加，同時(shí)抑制Bcl-2表達(dá)。
　　6、QIC1下調(diào)EGFR的活性進(jìn)而影響下游的STAT3，調(diào)節(jié)HKⅡ信號(hào)通路。
　　7、QIC1抑制人類乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF

6、-7/DOX的增殖并增強(qiáng)阿霉素對(duì)MCF-7/DOX細(xì)胞的抗腫瘤活性。
　　結(jié)論：新的喹諾酮-吲哚酮衍生物QIC1可通過(guò)EGFR-STAT3-HKⅡ通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。
　　目的：篩選20種喹諾酮-吲哚酮衍生物單體的抗腫瘤活性。
　　方法：采用MTT法測(cè)定20種喹諾酮-吲哚酮衍生物單體對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG-2、MCF-7、A549及Hela的細(xì)胞毒性的影響。
　　結(jié)果：篩

7、選出了其中一個(gè)抗腫瘤活性最強(qiáng)的單體化合物為 QIC1。
　　結(jié)論：在20種喹諾酮-吲哚酮衍生物單體中，QIC1的抗腫瘤活性最強(qiáng)。
　　目的：研究QIC1抗腫瘤活性的分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1)QIC1對(duì)腫瘤細(xì)胞HepG-2、MCF-7及A549的細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響：選用MTT法檢測(cè) QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7及 A549腫瘤細(xì)胞的增殖影響；采用流式細(xì)胞儀分析測(cè)定QIC1對(duì)H

8、epG-2、A549腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期影響；使用高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7及A549腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡影響；使用Western Blotting方法檢測(cè)對(duì)Bcl-2(凋亡因子)和Bax(促凋亡因子)的影響。
　　(2)QIC1對(duì)EGFR-STAT3-HKⅡ信號(hào)通路的影響：用Western Blotting法檢測(cè)QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7和A549腫瘤細(xì)胞中EGFR蛋白和p-EGFR、STAT

9、3蛋白和p-STAT3蛋白、HKⅡ蛋白、AKT蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)的影響；用MTT方法檢測(cè)，用STAT3 siRNA和HKⅡ抑制劑3-溴丙酮酸(3-BrPA)對(duì)腫瘤細(xì)胞預(yù)處理后，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　(1)MTT法結(jié)果顯示QIC1對(duì)HepG-2、MCF-7、及A549三種腫瘤細(xì)胞和正常肝細(xì)胞QSG7701作用48 h的IC50分別為：2.44±0.63μmol/L、1.85±0.54μmol/L、0.59±0

10、.12μmol/L；陽(yáng)性對(duì)照品Sunitinib對(duì)HepG-2、MCF-7、A549和正常肝細(xì)胞QSG7701作用48 h的IC50分別為：16.66±0.93μmol/L、17.96±1.13μmol/L、8.77±1.38μmol/L、17.00±0.16μmol/L；流式細(xì)胞儀測(cè)定法檢測(cè) QIC1可將HepG-2細(xì)胞周期阻斷于G2/M期；QIC1可能抑制A549細(xì)胞的DNA合成；高內(nèi)涵活細(xì)胞成像系統(tǒng)(利用 PI/Hoechst33

11、342雙染色法)檢測(cè)結(jié)果顯示，1μmol/L、2μmol/L和4μmol/LQIC1處理腫瘤細(xì)胞48h后，與陰性對(duì)照組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增大而增多，并且呈濃度依賴性。
　　(2)Western Blotting法結(jié)果顯示QIC1能顯著下調(diào)EGFR蛋白和p-EGFR、STAT3蛋白和p-STAT3蛋白、HK蛋白、AKT蛋白和p-AKT蛋白表達(dá)水平；MTT法我們觀察到QIC1的抗癌活性被STAT3 siRNA和3-BrPA

12、干擾抵消。此外，采用Western blotting法檢測(cè)我們還觀察到在這些細(xì)胞中STAT3基因沉默后HKⅡ基因的表達(dá)量減少。
　　結(jié)論：QIC1對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞(HepG-2、A549、MCF-7及 Hela)都有較強(qiáng)的抑制細(xì)胞增殖影響，具有同樣的趨勢(shì)，具有顯著的劑量依賴性，且無(wú)細(xì)胞毒性；QIC1阻斷腫瘤細(xì)胞HepG-2細(xì)胞周期于G2/M期和抑制A549細(xì)胞的DNA合成；QIC1可以誘導(dǎo)HepG-2、A549及MCF-7腫瘤細(xì)胞

13、凋亡，且呈現(xiàn)濃度依賴性?？偟慕Y(jié)果表明，EGFR-STAT3-HKⅡ通路下調(diào)可能是QIC1抗癌作用機(jī)制之一。
　　目的：研究QIC1對(duì)人類乳腺癌MCF-7/DOX耐藥細(xì)胞的耐藥性影響。
　　方法：用RT-PCR方法檢測(cè)在MCF-7/DOX和MCF-7細(xì)胞中EGFR和STAT3的mRNA表達(dá)水平；用Western Blotting法檢測(cè)在MCF-7/DOX和MCF-7細(xì)胞中EGFR和STAT3的蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)MCF-7/DO

14、X細(xì)胞中不同濃度的QIC1對(duì)EGFR和STAT3的蛋白表達(dá)水平的影響；MTT法檢測(cè)QIC1對(duì)MCF-7/DOX的抑制增殖影響；MTT法檢測(cè)QIC1無(wú)毒劑量作用 MCF-7/DOX后，對(duì)細(xì)胞耐 DOX的耐藥性影響。
　　結(jié)果：結(jié)果顯示在MCF-7/DOX和MCF-7/S細(xì)胞中EGFR、STAT3蛋白是過(guò)表達(dá)；在MCF-7/DOX中，QIC1可以降低 EGFR、STAT3的表達(dá)水平，呈劑量依賴性；QIC1可以提高 MCF-7/DOX對(duì)